JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:27 min • August 31st, 2026
Inicie com tecido de fígado de rato recelularizado congelado, contendo hepatócitos humanos, embutido em meio de criopreservação.
Neste tecido, os hepatócitos transduzidos expressam a proteína fluorescente verde esmeralda (EmGFP), uma proteína repórter codificada pelo vetor viral.
Use um criostato para cortar seções finas que mantenham a arquitetura celular e tecidual. Transfira as seções para uma lâmina.
Trate as seções com um detergente suave para permeabilizar a membrana celular.
Adicione um anticorpo primário anti-EmGFP que se liga especificamente à proteína relatora fluorescente expressa nas células transduzidas.
Lave para remover os anticorpos não ligados.
Introduza um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo vermelho, que se liga ao anticorpo primário, e depois lave.
Adicione um corante fluorescente azul específico para DNA que se liga ao DNA celular.
Sob um microscópio de fluorescência, a colocalização da fluorescência vermelha com os núcleos corados em azul confirma que os hepatócitos transduzidos no tecido hepático expressam com sucesso a proteína reporter viral.
Usando um bisturi, corte amostras de cada lobo hepático com cerca de meio centímetro de espessura e de 1,5 a 2 centímetros de comprimento. Incube as fatias em paraformaldeído 4% com sacarose 4% durante 90 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, lave as amostras três vezes com PBS por um minuto a cada lavagem. Após as lavagens, incube as amostras durante a noite em sacarose 8% a quatro graus Celsius. No dia seguinte, carregue as amostras em criomoldes contendo algum meio de fixação.
Evite introduzir bolhas de ar. Após o carregamento, cubra completamente as amostras com o meio de fixação e coloque-as a menos 80 graus Celsius. Após o congelamento, prepare crioseções de 10 mícrons das amostras utilizando um criotomo.
Colorir as amostras conforme necessário para confirmar a recelularização.