Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:33 min. • August 31st, 2026
Obtenha uma cultura de células humanas.
Adicione lentivírus que codificam um shRNA direcionado ao mRNA do hospedeiro sob um promotor responsivo à tetraciclina fundido a um operador.
O lentivírus também carrega genes para um repressor de tetraciclina e uma proteína de resistência a antibióticos, colocados sob um promotor constitutivo.
Incubar para permitir a entrega do RNA viral nas células hospedeiras.
O RNA é convertido em cDNA e integra-se ao genoma do hospedeiro.
Lave, adicione meio e incube para permitir a expressão do repressor da tetraciclina e da proteína de resistência ao antibiótico, gerando células transduzidas. O repressor da tetraciclina liga-se ao operador e suprime a expressão de shRNA.
Lave, adicione meio suplementado com antibiótico e incube.
Células transduzidas expressam a proteína de resistência ao antibiótico, permitindo sua sobrevivência seletiva na presença do antibiótico.
Adicione doxiciclina, um análogo da tetraciclina, ao cultivo.
A doxiciclina liga-se ao represor da tetraciclina, impedindo sua ligação ao operador e permitindo a expressão do shRNA.
O shRNA é processado em siRNA, que se incorpora ao RISC e degrada o mRNA alvo.
Isso gera células com silenciamento condic
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