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Microbiologia
0 vistas • 3:33 min • August 31st, 2026
Obtenha uma cultura de células humanas.
Adicione lentivírus que codificam um shRNA direcionado ao mRNA do hospedeiro sob um promotor responsivo à tetraciclina fundido a um operador.
O lentivírus também carrega genes para um repressor de tetraciclina e uma proteína de resistência a antibióticos, colocados sob um promotor constitutivo.
Incubar para permitir a entrega do RNA viral nas células hospedeiras.
O RNA é convertido em cDNA e integra-se ao genoma do hospedeiro.
Lave, adicione meio e incube para permitir a expressão do repressor da tetraciclina e da proteína de resistência ao antibiótico, gerando células transduzidas. O repressor da tetraciclina liga-se ao operador e suprime a expressão de shRNA.
Lave, adicione meio suplementado com antibiótico e incube.
Células transduzidas expressam a proteína de resistência ao antibiótico, permitindo sua sobrevivência seletiva na presença do antibiótico.
Adicione doxiciclina, um análogo da tetraciclina, ao cultivo.
A doxiciclina liga-se ao represor da tetraciclina, impedindo sua ligação ao operador e permitindo a expressão do shRNA.
O shRNA é processado em siRNA, que se incorpora ao RISC e degrada o mRNA alvo.
Isso gera células com silenciamento condicional dependente de doxiciclina.
Para gerar linhagens celulares estáveis, comece semeando células de câncer de cólon HCT-116 e células de câncer de mama MDA-MB-231 em uma placa de 12 poços com 50.000 células por poço.
Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células estiverem 60-70% confluentes, lavar as células com PBS e adicionar um mililitro de meio contendo vírus a cada poço. No dia seguinte, remover cuidadosamente o meio contendo vírus por aspiração.
Então, após lavar as células com PBS, adicione meio contendo FBS livre de tetraciclina. Após 72 horas, lave as células como antes e adicione meio suplementado com um micrograma por mililitro de puromicina para a seleção de células transduzidas pelo vírus. Selecione as células transduzidas pelo vírus cultivando-as na presença de puromicina por três a 14 dias.
Observe a morte parcial das células pelo puromicina nos poços com células transduzidas por vírus. Células não transduzidas não crescerão na presença de puromicina.
Verifique a eficiência do silenciamento condicional nas células de câncer de cólon HCT-116 e nas células de câncer de mama MDA-MB-231 resistentes à puromicina, adicionando meio com diferentes concentrações de doxiciclina e cultivando as células por 72 horas.