JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:51 min • August 31st, 2026
Utilize vetores lentivirais contendo o antígeno p24 do HIV-1, uma proteína marcadora usada para detecção.
Adicione um detergente para lisar e liberar a p24, em seguida dilua a amostra em série.
Utilize uma microplaca revestida com anticorpos monoclonais anti-p24 e um agente bloqueador para prevenir ligação não específica.
Adicione as diluições das amostras e os padrões de p24 como referências.
Incube para permitir a interação do p24 com os anticorpos por meio de um epítopo específico, depois remova os componentes não ligados.
Incubar com anticorpos policlonais anti-p24 que se ligam a diferentes epítopos no p24. Remover quaisquer anticorpos não ligados.
Adicione anticorpos ligados à peroxidase que se ligam aos anticorpos policlonais. Remova os anticorpos não ligados.
Adicione um substrato de peroxidase que se converte em um produto colorido.
Adicione um ácido para inativar a peroxidase e estabilizar o produto.
Meça a absorbância correspondente à intensidade da cor, que é proporcional à concentração de p24.
Gere o gráfico padrão e estime as concentrações das amostras para determinar o título viral.
Cubra uma placa de 96 poços de alta ligação com 100 microlitros de anticorpo monoclonal anti-p24 em uma diluição de um para 1.500, conforme o programa de vacinas contra a AIDS do NIH para o kit de ensaio de captura de antígeno p24 do HIV-1. Incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave a placa três vezes com 200 microlitros de TWEEN-20 0,05% em PBS frio.
Para evitar ligação não específica, bloqueie a placa com 200 microlitros de albumina sérica bovina a 1% por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave a placa com 200 microlitros de TWEEN-20 a 0,05% em PBS frio, três vezes. Depois, prepare as amostras de vetor concentradas e não concentradas para uma concentração final de 10%, diluindo o vetor com água bidestilada e Triton X-100.
Em seguida, prepare os padrões de HIV-1 utilizando diluição seriada de duas vezes, começando em cinco nanogramas por mililitro. Após diluir as amostras de vetor concentradas e não concentradas, pipete-as na placa em triplicata e incube a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave a placa, então adicione 100 microlitros de anticorpo policlonal de coelho anti-p24 em cada poço e incube a 37 graus Celsius por quatro horas.
Após seis lavagens, incubar a placa com anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado à peroxidase a 37 graus Celsius por uma hora. Após várias lavagens, incubar a placa com o substrato de peroxidase TMB à temperatura ambiente por 15 minutos. Adicionar ácido clorídrico 1 N para interromper a reação. E ler a absorbância em 450 nanômetros com um leitor de placas de absorbância.