Purificação de Partículas Virais Recombinantes de Células Renais Humanas Transfectadas

Inicie com um lisado celular contendo DNA celular agregado com proteínas celulares e partículas virais.

Adicione íons de magnésio, seguidos por uma nucleasse, para ativar a degradação enzimática do DNA celular e romper agregados de DNA–proteína.

Centrifugue para separar os detritos e coletar o sobrenadante contendo partículas virais.

Coloque o sobrenatante sobre um gradiente descontínuo de iodixanol com concentrações crescentes de cima para baixo e, em seguida, complete o tubo com tampão.

Ultracentrifugar para separar os componentes com base na densidade. As partículas virais acumulam-se na interface entre as camadas de alta e média densidade.

Insira uma agulha nesta interface e colete as partículas virais em um tubo.

Adicione um tampão contendo componentes estabilizantes, que previne a agregação das partículas virais.

Em seguida, transfira a solução para um tubo com um filtro de membrana.

Centrifugue para concentrar as partículas virais acima do filtro.

Adicione o tampão suplementado com agente estabilizante e centrifugue novamente para obter partículas virais purificadas.

Para colher as células transfectadas, desprenda e suspenda as células utilizando o meio de cultura para pipetar para cima e para baixo. Em seguida, transfira as suspensões celulares para tubos estéreis de 50 mililitros. Centrifugue as células a 500 vezes g por cinco minutos.

Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS a cada tubo e ressuspenda os pellets celulares antes de combinar todas as suspensões em um único tubo de 50 mililitros. Após centrifugar as células a 500 × g durante cinco minutos, descarte o sobrenadante. Para purificar o AAV, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de tampão de lise.

Congele o lisado a menos 80 graus Celsius ou em um banho de gelo seco–etanol. Em seguida, descongele-o a 37 graus Celsius. Agite o lisado em vórtex por um minuto antes de repetir o congelamento e descongelamento por mais duas vezes.

Em seguida, adicione cloreto de magnésio a um milimolar ao lisado descongelado. Então, adicione nucleases até uma concentração final de 250 unidades por mililitro. Incube a solução a 37 graus Celsius por 15 minutos para dissolver a agregação de proteína com DNA.

Centrifugue a amostra a 4.800 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, colete o sobrenadante. Enquanto isso, para preparar uma solução de gradiente de iodixanol a 17%, misture cinco mililitros de PBS 10X com 0,05 mililitros de cloreto de magnésio um molar, 0,125 mililitros de cloreto de potássio um molar, 10 mililitros de cloreto de sódio cinco molar e 12,5 mililitros de meio de gradiente de densidade.

Use água para ajustar o volume total a 50 mililitros. Após preparar as soluções em gradiente de 25%, 40% e 60% de acordo com o protocolo descrito no texto, use uma agulha e uma seringa para carregar cinco mililitros da solução em gradiente de 17% em um tubo de polipropileno. Em seguida, adicione cinco mililitros de cada uma das soluções em gradiente de 25%, 40% e 60%.

Coloque o lisado sobre o gradiente. Em seguida, encha o tubo com tampão de lise e cubra com uma rolha. Centrifugue o gradiente a 185.000 ×g e 16 °C por 90 minutos.

Após a centrifugação, utilize uma seringa para coletar a fração viral a 40%, inserindo uma agulha de 21 gauge na interseção entre as frações de 40 e 60%, evitando completamente a camada de 25%. Misture a fração viral com solução esterilizada de PBS de copolímero em bloco de polioxietileno polioxipropileno, ou PEG-PPG, até um volume total de 15 mililitros. Carregue a mistura em um tubo de filtração com corte de peso molecular de 100 kilodaltons.

Em seguida, centrifugue a amostra a 2.000 vezes g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Decante a solução a partir da base do tubo. Em seguida, use PEG-PPG para reabastecer o tubo de filtração até 15 mililitros.

Centrifugue o tubo a 2.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Após repetir o reenchimento e a centrifugação mais duas vezes, colete a fração purificada do vírus rAAV9 ainda acima do filtro.