Imortalização de Células Endoteliais via Transdução Retroviral de Oncogenes Virais

Utilize um meio contendo partículas retrovirais que codificam oncogenes virais e um gene de resistência a antibióticos.

Centrifugue o meio para remover os detritos celulares.

Colete o sobrenadante contendo as partículas virais e sobreponha-o a um cultivo de células endoteliais.

Incubar para permitir a entrada viral.

O RNA viral é transcrito reversamente em DNA, o qual se integra ao genoma do hospedeiro.

O gene de resistência a antibióticos produz uma proteína de resistência. Os oncogenes produzem proteínas que se ligam a proteínas supressoras de tumor que controlam a divisão celular e as inativam, prolongando a longevidade celular.

Substitua o meio por um meio fresco.

Incubar novamente para garantir a integração estável do DNA viral.

Remova o meio e lave as células.

Adicione uma solução de dissociação enzimática para destacar as células.

Transfira a suspensão celular, centrifugue e remova o sobrenadante.

Resuspenda o pellet e transfira-o para um frasco.

Adicione um antibiótico ao meio.

Somente as células que expressam a proteína de resistência ao antibiótico sobrevivem, selecionando as células imortalizadas por proteínas oncogênicas virais.

Após uma incubação durante a noite, colete o meio de cu