Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:07 min. • August 31st, 2026
Utilize um meio contendo partículas retrovirais que codificam oncogenes virais e um gene de resistência a antibióticos.
Centrifugue o meio para remover os detritos celulares.
Colete o sobrenadante contendo as partículas virais e sobreponha-o a um cultivo de células endoteliais.
Incubar para permitir a entrada viral.
O RNA viral é transcrito reversamente em DNA, o qual se integra ao genoma do hospedeiro.
O gene de resistência a antibióticos produz uma proteína de resistência. Os oncogenes produzem proteínas que se ligam a proteínas supressoras de tumor que controlam a divisão celular e as inativam, prolongando a longevidade celular.
Substitua o meio por um meio fresco.
Incubar novamente para garantir a integração estável do DNA viral.
Remova o meio e lave as células.
Adicione uma solução de dissociação enzimática para destacar as células.
Transfira a suspensão celular, centrifugue e remova o sobrenadante.
Resuspenda o pellet e transfira-o para um frasco.
Adicione um antibiótico ao meio.
Somente as células que expressam a proteína de resistência ao antibiótico sobrevivem, selecionando as células imortalizadas por proteínas oncogênicas virais.
Após uma incubação durante a noite, colete o meio de cultura das células PA317 e clarifique-o por centrifugação a 300 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Substitua o meio EGM de uma cultura de células endoteliais com 50% de confluência por 12 mililitros do meio PA317 clarificado. Incube as células por quatro horas.
Em seguida, substitua seis mililitros do meio PA317 por seis mililitros de meio EGM fresco e incube as células durante a noite. Posteriormente, remova o meio da cultura de células endoteliais e alimente as células com 12 mililitros de meio EGM fresco. Continue a incubação das células por mais 48 horas.
Para subcultivar as células endoteliais, remova o meio e lave as células com 12 mililitros de PBS sem cátions. Em seguida, adicione três mililitros de uma solução enzimática de dissociação comercial e incube as células a 37 graus Celsius por três minutos. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue as células a 300 × g por cinco minutos à temperatura ambiente.
Uma vez que o pellet seja formado, ressuspenda as células em meio EGM fresco e divida a suspensão igualmente em três frascos T75. Ajuste o volume das culturas para 12 mililitros de EGM por frasco. Em seguida, adicione 200 microgramas por mililitro de G418 para selecionar as células endoteliais transduzidas.