Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 4:23 min. • August 31st, 2026
Inicie com uma lâmina contendo células hospedeiras infectadas pelo vírus e permeabilizadas, onde os RNAs virais estão distribuídos entre os compartimentos nuclear e citoplasmático.
Adicione um tampão de pré-hibridização e incube em condições úmidas.
No tampão, os reagentes de bloqueio inibem sítios de ligação inespecíficos, enquanto os inibidores de RNase inativam as RNases e preservam a integridade do RNA.
Remova o tampão e adicione as sondas de oligonucleotídeos desnaturadas e marcadas com digoxigenina complementares ao RNA viral.
Incube no escuro para permitir a hibridização da sonda com o RNA, depois lave repetidamente.
Adicione um fixador para estabilizar os híbridos de sonda-RNA e, em seguida, lave repetidamente. Adicione um tampão suplementado com detergente para manter a permeabilidade celular.
Adicione um anticorpo anti-digoxigenina conjugado a um fluoróforo verde que interaja com a digoxigenina, depois lave repetidamente.
Fixe as células para preservar os complexos, depois lave novamente.
Adicione um corante intercalante de DNA para corar os núcleos. Lave o corante em excesso repetidamente.
Monte com uma lamínula e a selar.
Sob um microscópio confocal, visualize a fluorescência verde, refletindo a distribuição do RNA viral entre o núcleo e o citoplasma da célula hospedeira.
Após três lavagens com PBS conforme demonstrado, fixe novamente as amostras em formaldeído 4% em PBS por 10-15 minutos antes de uma segunda permeabilização conforme demonstrado. Em seguida, cubra a lâmina com papel alumínio para preservar o sinal fluorescente e prevenir o desbotamento pela luz.
E lave as células com cloreto de sódio citrato salino 2x, antes de aplicar 45 microlitros da solução de hibridização. Após uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada, adicione água destilada aos oligonucleotídeos antissenso de interesse para ajustar o volume de desnaturação a 10 microlitros. Desnature os oligonucleotídeos a 95 graus Celsius por cinco minutos, antes de adicionar 35 microlitros de solução de hibridização fresca por lâmina.
Em seguida, incubar as amostras de 10 a 24 horas na câmara umidificada a 37 graus Celsius, protegidas com papel alumínio. No dia seguinte, lavar as células com duas lavagens de 10 minutos em cloreto de sódio e citrato de sódio 2X à temperatura ambiente, seguidas por uma lavagem em cloreto de sódio e citrato de sódio 1X por 10 minutos, a 25 graus Celsius.
Após a última lavagem, fixe as células com formaldeído a 4% pré-resfriado em PBS, por 10-15 minutos no gelo, seguido por três lavagens com PBS fresco. Em seguida, permeabilize as amostras conforme demonstrado, seguido de incubação com anti-digoxigenina-FITC e BSA a 0,1% pré-resfriado em PBS, por uma hora a quatro graus Celsius. Ao final da incubação, lave as lâminas três vezes com PBS fresco e fixe as amostras com paraformaldeído a 4% pré-resfriado em PBS, por 10-15 minutos a quatro graus Celsius.
Após três lavagens em PBS, marque os núcleos com 0,4 microgramas por mililitro de DAPI e 0,5% de Triton-X pré-resfriado em PBS por 15 minutos no gelo, seguido por três lavagens finais em PBS. Monte as lâminas com microesferas fluorescentes, conforme relevante para o experimento e em meio de montagem apropriado. Após remover o excesso de meio de montagem com lenços estéreis, fixe uma lamínula em cada lâmina com várias camadas de esmalte incolor e utilize um microscópio de fluorescência para confirmar a execução bem-sucedida do experimento.
As imagens podem então ser obtidas em um microscópio confocal para coletar imagens das amostras entre uma hora e uma semana após o montagem, com uma ampliação de 630 vezes.