Purificação de Vetores de Vírus Adenoassociados Baseada em Cromatografia de Afinidade

Inicie com um lisado celular filtrado contendo vetores de vírus adeno-associado (AAV) e contaminantes derivados do hospedeiro.

Passe o lisado através de uma coluna de afinidade baseada em heparina.

As proteínas do capsídeo viral ligam-se eletrostaticamente aos grupos de heparina com carga negativa.

Lave a coluna com um tampão para remover contaminantes não ligados.

Adicione um tampão contendo detergente para solubilizar os detritos membranosos.

Enxágue novamente com o tampão sem detergente.

Introduza um tampão suplementado com cátions para criar um ambiente iônico, depois lave com um tampão de sal moderado para liberar impurezas fracamente ligadas.

Adicione um tampão de alta salinidade para interromper as interações entre a cápside e a heparina e eluir as partículas virais.

Colete as frações de eluição enriquecidas com partículas virais intactas e transfira-as para tubos concentradores centrífugos equipados com membranas de filtro.

Centrifugue os tubos para remover o tampão em excesso e, em seguida, colete as frações virais concentradas em um tubo.

Lave a membrana com o tampão para recuperar partículas virais residuais e maximizar o rendimento.

Deixe o lisado bruto descongelar a quatro graus Celsius durante a noite.

Uma vez descongelado, filtre-o usando um filtro de 0,22 mícron. Imediatamente antes das etapas de purificação, passe o concentrador centrífugo adicionando quatro mililitros de tampão de pré-tratamento do filtro para cada coluna de heparina-Sepharose que estiver sendo utilizada. Coloque o tubo em uma bomba peristáltica.

Execute sequencialmente as soluções e os meios. Prepare-se para a cromatografia conectando uma coluna de heparina-Sepharose de cinco mililitros à tubulação e passando 25 mililitros de DMEM Bazell pela coluna. Em seguida, carregue 0,2 micromolar do lisado bruto filtrado na coluna a uma taxa de fluxo de uma a duas gotas por segundo.

Lave a coluna sequencialmente para eluir cinco mililitros cinco vezes com HBSS contendo cloreto de sódio 300 milimolar, com magnésio e cálcio, e rotule as cinco eluições como E1 a E5. Quando pronto, gire o concentrador centrífugo contendo o tampão de pré-tratamento a 900 × g durante dois minutos. Descarte o fluxo passante. Lave o filtro do concentrador centrífugo com quatro mililitros de HBSS com magnésio e cálcio, girando a 1000 × g durante dois minutos.

Em seguida, adicione a eluição E2 ao concentrador centrífugo e gire a 1000 vezes g durante cinco minutos. Descarte o fluxo passante. Da mesma forma, gire a eluição E3 no concentrador centrífugo até que o vírus concentrado tenha um volume aproximado de um mililitro.

Remova o vírus concentrado do concentrador centrífugo usando uma ponteira filtrada P200 e colete-o em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mililitro. Após a coleta do vírus, enxágue o concentrador centrífugo com 200 microlitros de HBSS com magnésio e cálcio. Pipete para cima e para baixo vigorosamente durante 30 segundos para desprender qualquer vírus aderido à membrana e colete o vírus concentrado no mesmo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Agite bem o tubo.