Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:07 min. • August 31st, 2026
Utilize uma placa de microinjeção com uma gota de meio de cultura de embriões no centro, coberta com óleo mineral para prevenir a evaporação.
Coloque a placa sob um microscópio invertido.
Posicione uma capilar de microinjeção e uma pipeta de contenção em um conjunto de micromanipulador sob o microscópio.
A capilar de microinjeção é carregada com uma suspensão de vetores lentivirais contendo o transgene.
Em seguida, transfira os embriões de rato fertilizados para o meio.
Segure um embrião usando a pipeta de contenção aplicando sucção.
Com maior aumento, insira a capilar de microinjeção através do revestimento extracelular de glicoproteína do embrião, a zona pelúcida, e injete a suspensão lentiviral no espaço perivitelino.
Em seguida, transfira os embriões injetados para uma placa de cultura e incube.
O vírus entra no embrião e libera seu genoma contendo o transgene no citoplasma.
Posteriormente, ele é transcrito reversamente em DNA e integra-se ao genoma do embrião, incorporando o transgene.
Os embriões transduzidos estão agora prontos para o processamento.
Para a microinjeção de vetores lentivirais sob a zona pelúcida de embriões em estágio de uma célula, utilize um puxador de pipetas para preparar capilares de vidro borossilicato para microinjeção com um filamento. Após cada troca do filamento ou uso de um novo capilar de vidro, realize um teste de rampa para definir os parâmetros ideais.
Em seguida, utilize uma ponteira microloader para carregar aproximadamente dois microlitros de solução lentiviral recém-descongelada por pipeta de microinjeção sob uma cabine de fluxo laminar com biossegurança. Adicione uma gota de 100 microlitros de meio M2 ao centro da tampa de uma placa de Petri de 60 milímetros. Cubra o meio com óleo mineral e monte a pipeta de contenção e a capilar de microinjeção carregada com o vírus em um micromanipulador.
Coloque o prato de microinjeção sob um microscópio invertido e transfira de 15 a 20 embriões de estágio unicelular para a gota de M2 no prato de microinjeção. Capture um embrião com a pipeta de contenção e utilize uma ampliação de 400 vezes e a capilar de vidro para injetar a solução lentiviral sob a zona pelúcida, no espaço perivitelino, mantendo a capilar sob a zona pelúcida por um momento após a liberação do vírus. Quando todos os embriões tiverem sido injetados, utilize uma pipeta fina para devolver as células injetadas ao prato de cultura e retorne o prato ao incubador de cultura celular até o momento da implantação.