Purificação de Integrase Viral Utilizando Cromatografia de Afinidade

Inicie com uma suspensão de células bacterianas expressando integrase viral com marcação de polihistidina.

Sonicar a suspensão para romper as membranas bacterianas e liberar a integrase.

Transfira o lisado para um tubo de ultracentrifugação.

Centrifugar em alta velocidade para formar um pellet dos detritos celulares e coletar o sobrenadante.

Em seguida, pegue uma coluna cromatográfica preenchida com resina carregada com níquel e equilibre-a com o tampão.

Carregue o lisado clarificado na coluna.

Proteínas com histidinas ligam-se fracamente ao níquel, enquanto a integrase com marcação de polihistidina liga-se fortemente.

Lave com o tampão para remover as proteínas não ligadas, em seguida adicione o tampão de eluição com uma concentração linearmente crescente de imidazol.

A imidazol compete com a histidina pela ligação ao níquel e libera a integrase.

Colete as frações e transfira alíquotas para tubos contendo tampão de carregamento.

Aqueça para desnaturar as proteínas e, em seguida, carregue em um gel de poliacrilamida.

Realize a eletroforese e analise as bandas proteicas.

Identifique as frações contendo integrase pura, sem quaisquer proteínas contaminantes, e reúna-as para obter a integrase viral purificada.

Comece descongelando um pellet de E. coli que expressa a integrase do vírus espumoso prototípico em gelo. Use um sonicador equipado com uma biohorn de 0,5 polegada de diâmetro e uma microponta cônica de 0,125 polegada de diâmetro para sonificar por 30 segundos a 30% de amplitude, mantendo o tubo em gelo. Após a sonicação, transfira a amostra celular para um tubo de ultracentrífuga gelado e gire a 120.000 × g durante 60 minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, deve haver um pellet evidente, e o sobrenadante pode apresentar coloração amarelada. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico de 50 mililitros gelado. Em seguida, monte a coluna de CLAE com 110 milímetros de comprimento e 5 milímetros de diâmetro, contendo 1,5 mililitro de resina carregada com níquel.

Primeiro, conecte a coluna ao instrumento de CLPF e aplique o tampão. O instrumento deve estar coletando dados em tempo real de condutividade e absorbância ultravioleta em 280 nanômetros. As leituras de condutividade e UV devem estabilizar.

Se necessário, continue passando os buffers pela coluna até que as leituras estejam estáveis. Usando um superloop, aplique a amostra proteica na coluna a uma taxa de fluxo de 0,15 mililitros por minuto com um limite máximo de pressão de 0,5 megapascal. Conecte o superloop ao sistema FPLC AKTA.

Após lavar a coluna e eluir as proteínas, retire alíquotas de 15 microlitros do fluxo inicial, da lavagem e das frações com pico de absorbância a 280 nanômetros e adicione 15 microlitros de tampão amostra 2X SDS-PAGE a cada amostra. Ferva as amostras por três minutos. Carregue 10 microlitros de cada amostra em géis de SDS-PAGE a 10%, juntamente com 4 microlitros de padrões proteicos pré-marcados.

Inspeccione visualmente o gel para identificar as frações que parecem conter integrase do vírus fago protótipo quase puro. Combine essas frações e anote o volume durante a pipetagem. Isso geralmente corresponde a oito a dez mililitros.