Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:45 min. • August 31st, 2026
Inicie com uma suspensão de células bacterianas expressando integrase viral com marcação de polihistidina.
Sonicar a suspensão para romper as membranas bacterianas e liberar a integrase.
Transfira o lisado para um tubo de ultracentrifugação.
Centrifugar em alta velocidade para formar um pellet dos detritos celulares e coletar o sobrenadante.
Em seguida, pegue uma coluna cromatográfica preenchida com resina carregada com níquel e equilibre-a com o tampão.
Carregue o lisado clarificado na coluna.
Proteínas com histidinas ligam-se fracamente ao níquel, enquanto a integrase com marcação de polihistidina liga-se fortemente.
Lave com o tampão para remover as proteínas não ligadas, em seguida adicione o tampão de eluição com uma concentração linearmente crescente de imidazol.
A imidazol compete com a histidina pela ligação ao níquel e libera a integrase.
Colete as frações e transfira alíquotas para tubos contendo tampão de carregamento.
Aqueça para desnaturar as proteínas e, em seguida, carregue em um gel de poliacrilamida.
Realize a eletroforese e analise as bandas proteicas.
Identifique as frações contendo integrase pura, sem quaisquer proteínas contaminantes, e reúna-as para obter a integrase vira
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