Purificação de Integrase Viral Utilizando Cromatografia de Afinidade por Heparina

Inicie com uma fração purificada de enzima integrase viral contendo nuclease bacteriana residual como contaminante.

Carregue a amostra em uma coluna de heparina-Sepharose pré-equilibrada com um tampão de ligação de baixa salinidade.

À medida que a mistura passa pela coluna, a integrase liga-se mais fortemente ao ligante heparina do que à nucleases contaminantes.

Em seguida, aumente gradualmente a concentração de sal no tampão que flui através da coluna.

Em baixas concentrações de sal, as nucleases fracamente ligadas são eluídas primeiro, enquanto a integrase fortemente ligada é eluída posteriormente em concentrações mais altas de sal.

Colete as frações eluídas individualmente para separar a nuclease contaminante da integrase.

Adicione tampão amostral de SDS-PAGE a cada fração e aqueça para desnaturar as proteínas. Carregue as amostras em um gel de SDS-PAGE e realize a separação eletroforética.

Observe o gel corado.

Identifique as frações contendo uma banda proeminente de integrase sem proteínas contaminantes visíveis, indicando pureza aparente.

Para realizar a fracionamento por cromatografia de afinidade com heparina da integrase do vírus espumoso protótipo, reduza a concentração de cloreto