Visualização da Supressão Transcricional em Células Infectadas por Vírus

Inicie com lamínulas contendo células de mamíferos previamente tratadas com um análogo de uridina, sendo um grupo infectado com o vírus e o outro não infectado.

Em células infectadas por vírus, proteínas virais ligam-se à maquinaria de transcrição do hospedeiro e inibem a produção de RNA do hospedeiro, enquanto em células não infectadas, a síntese de RNA permanece ininterrupta.

Lave com um tampão. Adicione paraformaldeído para fixar as células e, em seguida, lave. Adicione um detergente para permeabilizar as membranas celulares e, em seguida, lave.

Transfira as lamínulas para uma câmara úmida.

Adicione a solução de coloração por "click" contendo azida fluorescente, um catalisador e um agente redutor, depois incube no escuro.

O agente redutor ativa o catalisador, o que permite que a azida fluorescente se ligue ao RNA nascente marcado com uridina.

Lave as lamínulas em tampão, mergulhe-as em água e remova o excesso de umidade.

Usando um meio de montagem antidesvanecimento, monte as lamínulas em uma lâmina e seque ao ar.

Sob um microscópio de fluorescência invertido, a redução na intensidade do sinal em células infectadas em comparação com células não infectadas indica supressão transcricional