Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:53 min. • September 30th, 2026
Inicie com células epiteliais infectadas com o vírus vaccinia e transfectadas com um vetor plasmidial de recombinação.
O vetor carrega um gene alvo marcado com fluorescência verde e um gene de seleção metabólica marcado com fluorescência vermelha sob um promotor viral.
Durante a replicação do DNA viral, o cassete do plasmídeo é inserido no genoma viral.
Coletar as células em meio sem soro.
Utilize ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células e liberar os vírus.
Prepare diluições seriadas do lisado.
Infecte células epiteliais frescas com o lisado diluído para obter placas individuais separadas.
Adicione meio contendo soro para a sobrevivência celular e um reagente de seleção metabólica, em seguida incube.
O reagente de seleção inibe enzimas envolvidas na síntese de nucleotídeos. Apenas as células infectadas que carregam o gene de seleção metabólica expressam uma enzima alternativa que permite a síntese de nucleotídeos, possibilitando a sobrevivência.
Remova o meio e observe em um microscópio de fluorescência.
A presença de fluorescência vermelha e verde em uma placa indica integração bem-sucedida do cassete e expressão do gene alvo.
Infecte uma monocamada de células BS-C-1 com
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