Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:55 min. • September 30th, 2026
Retire o meio de uma cultura de células cancerígenas humanas que expressam uma proteína-alvo endógena.
Prepare uma suspensão de adenovírus recombinante carregando um gene que codifica a proteína-alvo marcada com fluoróforo.
Adicione um pequeno volume da suspensão viral às células para garantir um contato próximo entre o vírus e a superfície celular.
Incube com agitação ocasional para permitir a adesão viral.
Adicione meio adicional à cultura.
Em seguida, introduza um complexo de siRNA–fosfato de cálcio para direcionar o mRNA da proteína-alvo endógena e incubar.
O fosfato de cálcio aumenta a captação do siRNA, e o siRNA é carregado no RISC.
O complexo siRNA-RISC então se liga ao mRNA alvo e o cliva, inibindo a expressão proteica.
Simultaneamente, o adenovírus entra na célula e libera seu DNA, que orienta a expressão da proteína-alvo marcada com fluoróforo.
Isso permite o esgotamento da proteína-alvo endógena e a substituição simultânea pela proteína marcada com fluoróforo.
Lave as células com tampão e realize a imagem de fluorescência para analisar a proteína-alvo.
Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada condição e adicione 400 microlitros de alpha MEM sem soro, aquecido.
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