Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:27 min. • September 30th, 2026
Inicie com suspensões de partículas semelhantes a vírus (VLPs) mutantes purificadas de folhas de tabaco infectadas.
Os VLPs mutantes contêm resíduos de cisteína inseridos geneticamente em posições específicas da proteína do capsídio viral.
Adicione um corante fluorescente conjugado com maleimida e incube a mistura no escuro.
O maleimida liga-se apenas aos resíduos de cisteína expostos na superfície das partículas semelhantes a vírus (VLPs), enquanto as cisteínas enterradas dentro da estrutura proteica permanecem inacessíveis e não são marcadas.
Adicione um agente redutor para bloquear qualquer corante não reagido e prevenir marcação inespecífica.
Carregue as amostras em colunas de dessalinização preenchidas com uma resina porosa, em seguida centrifugue para purificar as VLPs marcadas.
Os corantes não reagidos e os agentes redutores difundem-se nas esferas porosas da resina e são retidos, enquanto as VLPs maiores são excluídas dos poros e eluem primeiro.
Os VLPs marcados fluorescentemente podem agora ser analisados usando eletroforese em gel.
As faixas fluorescentes no gel mostram mutantes marcados com resíduos de cisteína expostos na superfície.
Após produzir os transcritos de T7-RNA com ca
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