Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:51 min. • September 30th, 2026
Inicie com partículas semelhantes a vírus, ou VLPs, contendo ligações dissulfeto expostas na superfície do capsídeo.
Adicione um agente redutor para clivar as ligações dissulfeto, gerando grupos tiol livres, preservando ao mesmo tempo a estrutura do capsídeo.
Combine as VLPs reduzidas com um polietilenoglicol reativo a tióis, ou ligante PEG, para prevenir a reoxidação de tióis.
O ligador PEG reconstitui cada par de tióis formando duas ligações covalentes.
Essa conjugação covalente também forma uma estrutura fluorescente que aparece em amarelo brilhante sob iluminação UV.
Rotacione a mistura por um período prolongado para permitir a conjugação completa.
Utilizando filtração centrífuga, purifique as VLPs PEGiladas removendo moléculas pequenas não reagidas, mantendo os conjugados intactos.
Realize o SDS-PAGE não redutor para detectar a ligação de PEG, indicada por uma banda fluorescente da proteína do capsídeo.
Avalie a integridade estrutural utilizando eletroforese em gel de agarose nativo, em que bandas semelhantes para VLPs com e sem PEG confirmam a presença de VLPs intactos.
Este protocolo produz VLPs fluorescentes e funcionalizadas com PEG adequadas para aplicações de imagem ou entrega di
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