C. elegans Aprender Butanona Positivo, de curto prazo e de longo prazo Ensaios Memória Associativa

O objetivo geral do experimento a seguir é testar a memória de curto e longo prazo de uma associação positiva aprendida entre alimento e o quimioatraente butano, utilizando C. elegans como modelo. Isso é alcançado primeiramente pela privação de alimento por uma hora em vermes jovens adultos, sincronizados e bem alimentados.

Em seguida, os vermes são treinados na presença de alimento e butanona, por condicionamento massivo para memória associativa de curto prazo e por condicionamento espaçado para memória associativa de longo prazo. Após o condicionamento, a quimiotaxia em direção à butanona é medida e comparada à quimiotaxia de animais ingênuos. Para estudar a retenção da memória, são obtidos resultados que mostram a duração da memória associativa de curto e longo prazo da associação aprendida entre alimento e butanona, com base em alterações no índice de aprendizagem.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de envelhecimento cognitivo e doenças, como quais vias genéticas são necessárias para a função neuronal no envelhecimento normal e em estados de doenças neurodegenerativas, e como a aprendizagem e a memória podem ser aprimoradas. Em condições de comprometimento cognitivo, os vermes são preparados utilizando métodos padrão em placas de meio de crescimento alto de 100 milímetros, semeadas com um mililitro de E. coli OP50. Utilize adultos jovens numa densidade de cerca de 5.000 vermes ou menos por placa.

Colete os vermes despejando suavemente o tampão M nove na placa e girando para soltar os vermes. Tente minimizar a agitação, o que pode desalojar bactérias indesejadas. Em seguida, incline a placa e retire a mistura de tampão e vermes a partir do canto.

Usando uma pipeta P1000, transfira os vermes para um tubo cônico de 15 mililitros. Tendo o cuidado de não pipetar os vermes contra a parede, caso os vermes permaneçam na placa.

Repita este passo uma a duas vezes. Deixe os vermes sedimentarem no fundo do tubo por ação da gravidade. A centrifugação não é recomendada para obter os melhores resultados.

Uma vez sedimentados, remova o sobrenadante por aspiração e lave com pelo menos três a quatro mililitros de tampão M nove. Trabalhe rapidamente para evitar a inanição. Repita este procedimento duas vezes, perfazendo um total de três lavagens.

Neste momento, um grupo de vermes pode ser separado para servir como o grupo ingênuo nos ensaios de quimiotaxia que serão demonstrados posteriormente; para pré-condicionar os vermes para o treinamento, adicione três a quatro mililitros de tampão M nove ao tubo e deixe os vermes em jejum à temperatura ambiente por uma hora. Prepare as placas de condicionamento estriando dois microlitros de butano a 10% em etanol a 95% no interior das tampas de placas NGM de 60 milímetros que foram semeadas com 500 microlitros de E. coli OP50. Remova o sobrenadante do tubo de vermes em jejum e use uma pipeta P1000 para transferir de 100 a 200 microlitros de vermes para cada placa de condicionamento. Incube as placas de condicionamento à temperatura ambiente por uma hora após o condicionamento.

Lave os vermes das placas com cerca de um mililitro de tampão M nove e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Repita os métodos de lavagem suave demonstrados anteriormente até que o tampão pareça claro. Após a lavagem, um subconjunto de vermes pode ser removido e testado no ensaio de quimiotaxia para servir como o grupo de tempo zero para a aprendizagem associativa de uma vez a concentração máxima, preparando placas que representam pontos de tempo adicionais.

Transfira de 100 a 200 microlitros de vermes para placas NGM de 60 milímetros com semeadura. Incube essas placas pós-condicionadas por 0,51 ou duas horas à temperatura ambiente. Após cada ponto temporal, lave suavemente os vermes das placas para um tubo cônico de 15 mililitros e mais uma ou duas vezes.

Com o tampão M nove, seguindo os mesmos procedimentos suaves de lavagem, a memória associativa de curto prazo é testada utilizando o ensaio de quimiotaxia, que será demonstrado posteriormente. Prepare as placas de condicionamento e os vermes conforme demonstrado para o treinamento de curto prazo, mas permita que os vermes incubem à temperatura ambiente por apenas 30 minutos. Após a incubação, colete os vermes conforme demonstrado anteriormente.

Transfira-os para placas NGM de 60 milímetros NÃO SEMEADAS. Mantenha os vermes nas placas não semeadas à temperatura ambiente por 30 minutos. Após os vermes estarem em jejum, lave-os com tampão M nove e coloque-os novamente no tubo cônico de 15 mililitros. Repita esses passos até que um total de sete blocos de condicionamento e seis blocos de jejum tenham sido concluídos.

Quando a condicionamento estiver completo, lave os vermes das placas de condicionamento de volta para um tubo cônico. Como mostrado anteriormente, um grupo de vermes pode ser usado para testar aprendizado associativo espaçado sete vezes imediatamente após o condicionamento. Transfira a população remanescente de vermes para placas HGM de 100 milímetros contendo um mililitro de OP50.

Novamente, aplique de 100 a 200 microlitros de vermes por placa para garantir que haja bactérias suficientes para sustentar a população. Incube as placas pós-condicionamento a 20 graus Celsius por 16, 24 ou 40 horas, representando os pontos temporais de memória associativa de longo prazo, para testar a memória associativa de longo prazo da associação conhecida com o alimento butan. Lave suavemente os vermes das placas para um tubo cônico de 15 mililitros e, novamente, uma a duas vezes com tampão M nove após cada ponto temporal e teste os vermes no ensaio de quimiotaxia.

Para preparar as placas para o ensaio de quimiotaxia, marque a parte inferior de placas NGM de 100 milímetros não seladas com pontos próximos à borda em três locais, conforme mostrado aqui. Aplique um microlitro de azida de sódio um molar nos pontos de odorizante e controle. Faça isso não mais do que 15 minutos antes de iniciar o ensaio, para minimizar a difusão dos agentes paralisantes.

Em seguida, aplique um microlitro de etanol 95% e um microlitro de butanona 10% em cada um dos respectivos locais marcados na placa de ensaio. Sobre o azoteto de sódio previamente aplicado. Remova o máximo possível do tampão M nove do tubo com os vermes sedimentados.

Use uma pipeta P20 com ponteira pré-cortada para aplicar 15 microlitros de vermes em três intervalos de cinco microlitros cada, na origem da placa de ensaio. Em seguida, enrole a ponta de um lenço Kim em um ponto fino e use-o para absorver o excesso de tampão M nove. Tendo cuidado para não perfurar o ágar.

Remover o excesso de tampão libera os vermes na placa de ensaio. Se utilizar imagem para contar os vermes, uma imagem da origem imediatamente após essa liberação fornecerá o número total de animais em uma placa de ensaio. Incubar a placa de ensaio de quimiotaxia por uma hora à temperatura ambiente após a incubação e contar o número de vermes nos pontos de origem, etanol e butanona, bem como o número total de vermes na placa de ensaio.

Em geral, os vermes paralisados pelo azoteto de sódio estarão dentro de um raio de um centímetro dos pontos e parecerão completamente retos. Com muitos animais empilhados uns sobre os outros, os vermes podem ser contados manualmente ou quantificados utilizando software de imagem e análise. Preferimos este último método pela facilidade e confiabilidade dos resultados.

Após quantificar os vermes nos pontos de origem dos locais com etanol e butanona, calcule o índice KeyAx conforme mostrado aqui. O índice de quimiotaxia típico para vermes selvagens em resposta à butanona 10% é de aproximadamente 0,2. O treinamento massivo ou espaçado geralmente aumenta o índice de QUIMIOTAXIA para 0,7 a 0,8 no tempo zero, resultando em um índice de aprendizado de cerca de 0,6.

A quimiotaxia ingênua é altamente sensível aos cuidados adequados com os vermes. Esta figura demonstra a diferença acentuada no índice de quimiotaxia entre vermes ingênuos bem alimentados e desnutridos e destaca a importância de uma técnica adequada. A retenção de memória é refletida pelo tempo necessário para o índice de quimiotaxia retornar aos níveis ingênuos quando o índice de aprendizado é igual a zero em animais selvagens.

A memória associativa de curto prazo começa a declinar uma hora após o treinamento em massa, que dura cerca de duas horas, e é independente do fator de transcrição kreb, por comparação. A memória associativa de longo prazo normalmente não começa a declinar significativamente até 16 horas após o treinamento espacial, que pode durar até 40 horas, e é dependente de Creb. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os ensaios de quimiotaxia podem ser influenciados pela privação de alimento ou por odores excessivos no ambiente, e também que a memória e os vermes podem ser perturbados por agitação física excessiva.