Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

O objetivo geral deste procedimento é realizar fenotipagem de alto rendimento com camundongos vivos ou fixados, utilizando ressonância magnética múltipla do cérebro de camundongos. Isso é realizado primeiramente anestesiando cada camundongo. Em seguida, para a aquisição in vivo, coloque cada camundongo em um suporte de tamanho apropriado antes de montá-lo em uma matriz de carregamento e posicioná-lo no interior do orifício do ímã.

Ou, para imagem ex vivo, realize uma perfusão transcardíaca, isole a estrutura do crânio e coloque-a em tubos de imagem, os quais são então posicionados em uma matriz de bobina solenoide de 16 canais posicionada no interior do orifício do ímã. Em última análise, podem ser obtidos volumes tridimensionais de imagens por ressonância magnética que mostram imagens cerebrais de alta qualidade, adequadas para fenotipagem, incluindo estruturas maiores e menores no cérebro do camundongo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a histologia, é que ela preserva a anatomia macroscópica dos espécimes ainda dentro de seus crânios e permite cobertura completa do cérebro e análise tridimensional.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas biomédicas, como a relação entre genes e distinções anatômicas que representam fenótipos no modelo murino de doenças. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica encontrarão desafiadora a elaboração de sistemas personalizados de posicionamento de camundongos e de matrizes de bobinas de radiofrequência necessárias para a aquisição de imagens cerebrais de alto rendimento. O mais desafiador: antes de iniciar este protocolo, obtenha aprovação para todos os procedimentos de manipulação em massa junto ao comitê institucional de cuidados com animais, comitê institucional para o uso e cuidado de animais ou órgão equivalente, além de realizar primeiros procedimentos como identificação e pesagem.

Os registros dos animais devem ser realizados dentro de uma câmara de segurança biológica. Em seguida, transfira os animais para um recipiente plástico autoclavável para transporte até a câmara de indução de ressonância magnética. Anestesie os animais a serem escaneados na câmara de indução pré-aquecida utilizando 4% de ISO fluoreto e quatro litros por minuto de oxigênio.

Os animais estão totalmente anestesiados quando deixam de responder ao aperto na pata. O pêlo do tórax pode ser removido usando um depilador, como o nare, se necessário, para proporcionar melhor contato com os dispositivos de ECG e monitoramento de temperatura integrados à plataforma personalizada. Além disso, aplique ISV, como lágrimas artificiais PMM, nos olhos para prevenir ressecamento e administre aproximadamente 0,3 mililitros de soro fisiológico por injeção subcutânea.

Para hidratar os animais. Agora, coloque os camundongos em trenós individuais com sondas embutidas de ECG, respiração e temperatura. Tenha cuidado para posicionar as apêndices dianteiras e traseiras nas depressões encontradas nos trenós.

Quando for necessário monitoramento ECG, certifique-se de que as regiões livres de pelos na parte inferior do camundongo estejam alinhadas com as sondas de ECG, imobilize cada animal com uma tira craniana e uma tira nasal e, em seguida, deslize cada suporte em um tubo cônico de 50 mililitros aberto nas extremidades. Até sete camundongos vivos podem ser preparados para varredura em uma única sessão de imagem. Em seguida, fixe os tubos cônicos no arranjo de carregamento.

Certifique-se de conectar todas as linhas de monitoramento fisiológico assim que todos os animais forem posicionados. Ajuste o nível de isoflurano no interior do ímã para 2% e o nível de oxigênio para oito litros por minuto. Agora transporte o conjunto de posicionamento até o ímã e coloque-o no sistema de trilhos.

Utilize o sistema de trilhos para acoplar o conjunto de carregamento com a colmeia de camundongos, que foi projetada para posicionar os camundongos uniformemente em cada bobina de radiofrequência posicionada no centro do orifício do ímã. Quando inserido completamente no ímã, os tubos de centrífuga se acoplam ao sistema de fornecimento de anestésico dentro das bobinas de RF, conforme mostrado aqui; o flúor ISOF misturado com oxigênio é fornecido pela colmeia de camundongos ao espécime através de um tubo ao longo do eixo de cada bobina individual. Essa mistura de gás anestésico flui para dentro dos tubos, passando pelos camundongos, e é coletada por uma unidade de aspiração ativa conectada à parte traseira do conjunto de carregamento.

Com base nas leituras fisiológicas dos animais, como respiração e temperatura, os níveis de isof devem ser ajustados entre 0,9 e 2%. Agora, realize a varredura dos animais utilizando uma sequência de eco rápido por bin. A duração de cada varredura tridimensional é de aproximadamente três horas, com uma resolução de imagem resultante de 125 micrômetros. Certifique-se de monitorar as leituras de ECG, respiração e temperatura de cada animal durante todo o procedimento de varredura.

Os animais também devem ser mantidos aquecidos durante a sessão de varredura com um fluxo de ar aquecido. Quando a varredura estiver concluída, remova o conjunto de carregamento do ímã e coloque-o em uma câmara de indução aquecida contendo 100% de oxigênio. Descarregue os animais dos tubos e transfira-os para recipientes plásticos herméticos para transporte até uma câmara de segurança biológica.

Por fim, coloque os animais em uma gaiola aquecida e livre de correntes de ar e permita que se recuperem da anestesia para a imagem ex vivo dos animais. Primeiro, anestesie completamente os animais por meio de injeção intraperitoneal de uma combinação de cetamina e xilazina. Antes de iniciar a perfusão, avalie o plano cirúrgico da anestesia por meio da compressão do dedo do pé ou da pata.

Abra a cavidade torácica e insira uma agulha ou um conjunto de infusão com segurança no ventrículo esquerdo do coração. Em seguida, corte o átrio direito para iniciar a perfusão transcardíaca. Primeiro, realize uma lavagem com 30 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 1x à temperatura ambiente, misturada com uma microlitro por mililitro de heparina e dois milimolares de pro hands, utilizando uma taxa de fluxo de aproximadamente 100 mililitros por hora.

Isso deve levar cerca de 20 minutos. Em seguida, realize uma passagem de fixação com 30 mililitros de paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente, misturado com dois milimolares de pro hands, a uma velocidade de 100 mililitros por hora. Agora, decapite o animal e remova a pele, a mandíbula inferior, as orelhas e a ponta cartilaginosa do nariz.

Em seguida, coloque a estrutura craniana remanescente em paraformaldeído 4% misturado com dois milimolares de pro hands e deixe durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira o espécime para uma solução de tampão salino fosfato 1x misturado com 0,02% de azida de sódio e dois milimolares de pro hands para conservação. A aquisição de imagens tridimensionais de alta resolução por ressonância magnética em sete Tesla deve ocorrer pelo menos quatro dias, mas não mais do que dois meses e meio após a fixação.

Após a perfusão, coloque os cérebros a serem imageados em uma matriz de bobina solenoide de 16 canais e posicione-a no escâner. Em seguida, realize a aquisição das amostras utilizando uma sequência de eco de spin rápido.

A duração deste exame é de aproximadamente 12 horas, e as imagens finais terão uma resolução isotrópica de 32 micrômetros. Após a conclusão do exame, remova os espécimes da bobina de imagem e coloque cada crânio em uma solução de formalina 10% com pro hands a dois milimolares para preservação representativa in vivo. Múltiplas imagens cerebrais de camundongo obtidas a partir de um exame de três horas são mostradas aqui.

Esta figura mostra três eixos de visualização para cada um dos sete camundongos escaneados. Exibido. Aqui temos uma imagem representativa de cérebro ex vivo com resolução isotrópica de 32 mícrons. E aqui podemos ver uma renderização 3D de um volume de imagem ex vivo após dominado.

Essa técnica in vivo pode ser realizada em três a quatro horas se for executada corretamente. Essa técnica pode ser utilizada por pesquisadores em diversas áreas biomédicas para investigar doenças como lúpus, Huntington e doença de Alzheimer no modelo de camundongo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter imagens cerebrais de alta qualidade por meio de ressonância magnética, tanto em espécimes vivos quanto fixados.

Obrigado por assistir.