Name: Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a isolar ribossomos contendo peptidil-tRNAs específicos usando extração magnética com mRNAs biotinilados. Este método avança estudos de função e estrutura ribossomal em biologia molecular.

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LRC-V. desejos de dedicar este artigo à memória do Dr. Adriel D. Johnson, um professor maravilhoso, cuja prioridade número um era sempre a educação dos estudantes. Nós sentimos sua falta, Adriel. Somos gratos a Jacqueline Moreno por sua ajuda na realização das experiências descritas neste estudo. Este estudo foi suportado por uma concessão fornecida para CY da National Science Foundation, MCB-0615390, e por fundos start-up desde a LRC-V. da Universidade do Alabama, em Huntsville.

1. Preparação de células Extrato grátis. <ol><li> Dois gramas de uma coli Escherichia seca bacteriana pellet obtido a partir de meados log-culturas fase são lavados, por duas vezes, com meio litro de tampão contendo 10 mM A Tris-acetato, pH 8,0, 14 mM de acetato de magnésio, 60 mM acetato de potássio e 50 mg / phenylmethanesulphonylfluoride mL (PMSF) por centrifugação a 5000 X g por 5 min a 4 ° C. Após a lavagem, o pellet bacteriano é ressuspenso em 40 mL de tampão A. </li><li> As células bacterianas são interrompidos usando uma imprensa francesa, a aplicação de pressão 6000 psi. Esta pressão corresponde a 600 unidades com um pistão de uma polegada. A suspensão interrompido é coletado em um tubo de vidro limpo (50 mL). </li><li> A suspensão interrompido é tratada com 1 mM ditiotreitol (DTT) e é centrifugado a 30.000 xg por 30 min. O procedimento é repetido centrifugação, utilizando o sobrenadante resultante. O sobrenadante final é dispensado (1 mL) em microtubos. Finalmente, as alíquotas são congeladas usando uma mistura de gelo etanol seco ou nitrogênio líquido, e são armazenadas a -60 ° C ou -80 ° C. </li></ol> 2. Preparação de Extratos celular grátis empobrecido de RF2. <ol><li> 4,5 mL de proteína A Sepharose 4B contas de chorume são misturados com 5 mL de um anti-soro anti-RF2 usando uma roda girando em temperatura ambiente, durante uma hora. A mistura é centrifugada a 2500 xg para separar as contas do anti-soro. Após descartar o sobrenadante, estes grânulos contendo os anticorpos anti-RF2 (anti-RF2 esferas) são posteriormente lavadas por ressuspensão em 1 mL de tampão B contendo 35 mM Tris-acetato pH 7,8, 10 mM de acetato de magnésio, 30 mM acetato de amónio, 60 glutamato de potássio mM e 5 mg / mL de leupeptin inibidor de protease. As esferas anti-RF2 são então separados do buffer B por centrifugação utilizando as mesmas condições acima indicadas. O procedimento de lavagem é repetida duas vezes. </li><li> Um mL do extrato livre de células é misturado com 150 mL de anti-RF2 contas usando uma roda giratória, a 4 ° C, por duas horas. A mistura é centrifugada a 10.000 xg para separar o extrato livre de células dos grânulos. O sobrenadante é removido e tratado novamente com outro mL 150 de anti-RF2 contas. Este procedimento é repetido mais uma vez com a solução de extrato livre de células resultantes. A solução extrato final livre de células é dispensado (100 mL) em microtubos. As alíquotas são congeladas usando uma mistura de gelo etanol seco ou nitrogênio líquido, e são armazenadas a -60 ° C ou -80 ° C. </li></ol> 3. Elaboração de um modelo de DNA. <ol><li> Prepare a 1 mL de reacção da PCR através da mistura de 600 femtomoles do modelo plasmídeo contendo a seqüência a ser traduzido (Fig. 1), com 0,4 nanomoles de cada um dos oligodeoxynucleotides indicado na Fig. 1, 0,2 micromoles de cada dNTP e 50 U de Taq- DNA polimerase no buffer fornecido pela Stratagene Co. Executar a reação de amplificação nas condições a seguir: 94 ° C por 2 min, (94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min; por 30 ciclos) e 72 ° C por 12 min. </li><li> Purificar o PCR-produtos por precipitar o DNA pela adição de volume de 1 / 10 de 3 M acetato de sódio, pH 5,2 e 2 volumes de etanol gelado. Repita o procedimento de precipitação mais uma vez. Ressuspender o DNA em 100 mL de dietil-pyrocarbonate (DEPC) de água tratada. Normalmente, este procedimento produz 100 mg de um produto DNA 600 pb. </li><li> Verificar a integridade dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose. </li></ol> 4. Preparação de Biotina mRNA rotuladas. <ol><li> Prepare uma mL 100 in vitro a reação de transcrição na água tratada DEPC através da mistura de 5 mg do fragmento de DNA PCR gerados com 0,5 micromoles de ATP, CTP, GTP, 0,3 micromoles de UTP, 50 nanomoles de biotina-16-UTP, e 10 mL de T7 mix enzima no buffer fornecido pela Promega Co. Incubar a mistura de reação a 37 ° C por 3 horas. Para quantificar a quantidade de mRNA obtidos, o modelo de DNA deve ser eliminada pela adição de RNase DNase. Incubar a reação a 37 ° C por 10 min. </li><li> Purificar os produtos mRNA por precipitar o RNA, adicionando volume 1 / 10 de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 e 2 volumes de etanol frio. Repita o procedimento de precipitação mais uma vez. Ressuspender o mRNA em 100 mL de água tratada DEPC. Normalmente, este procedimento produz entre 02/01 mg de biotina a 600 nt rotulados produto mRNA. </li><li> Verificar a integridade dos produtos mRNA biotina marcada por eletroforese em gel de agarose. </li></ol> 5. Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo um peptidil-tRNA. <ol><li> Prepare 500 mL de uma mistura de reação in vitro de tradução em água tratada DEPC pela mistura de 10-15 mg de biotina marcado mRNA com 75 nanomoles de cada um dos dezenove aminoácidos-todos, exceto o aminoácido que será substituído por um ácido amino radioativo , 50 μCi de um ácido amino radioativo (37MBq) e 20-5 0 mL de RF2 depleção extrato livre de células, em uma mistura de reação contendo tampão 40 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM de acetato de magnésio, 175 mM de acetato de potássio, acetato de amônio 10 mM, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 GTP mM, 30 mM fosfoenolpiruvato (PEP), 0,3 piruvato quinase U / mL (PK), 3,5% de polietileno glicol 8000, um espermidina mM, 20 mcg / mL de ácido folínico, e 250 mcg / mL tRNA de E. coli. Incubar a mistura de reação a 37 ° C por 10 minutos. A ordem de adição dos componentes de reação é muito importante. O extrato livre de células deve ser misturado primeiro com a solução tampão contendo os aminoácidos e da mistura final incubadas por 5 min à temperatura ambiente para permitir a ativação do ribossomos. Mais tarde, a biotina marcada com mRNAs são adicionados. Para as análises estruturais utilizando procedimentos de modificação química, a adição de um ácido amino radioativo não é necessária. </li><li> Adicione à mistura de reação de tradução - 3 mL de contas paramagnética estreptavidina (SMB) suspenso em tampão C contendo 35 mM Tris-acetato, pH 8,0, 10 mM de acetato de magnésio, 175 mM de acetato de potássio, 10 mM acetato de amônio e 1 mM DTT. Incubar a nova suspensão em temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Separar o SMB a partir da mistura pela aplicação de um campo magnético (MF), utilizando se de separação magnética. </li><li> Ressuspender o SMB em tampão C e separar as contas novamente usando o MF. Repita este procedimento de lavagem duas vezes. Volte a suspender as contas em 500 mL de tampão C, loja da suspensão sobre o gelo e realizar o próximo procedimento imediatamente. </li></ol> 6. Análise dos ribossomos isolados Contendo o peptidil-tRNA. Para peptidil-tRNA <ol><li> Misturar 10 mL do SMB (suspenso em tampão C) com 10 mL de um tampão de carregamento contendo 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) de glicerol, sulfato de sódio 4% dodecil, 2 mM DTT e 0,2 mg / mL de azul de bromofenol. Resolver os componentes ligados às esferas executando as amostras em 10% géis de poliacrilamida Tris-tricine. </li><li> Secar o gel usando um secador de vácuo gel. </li><li> Verificar a integridade e purificação do peptidil-tRNA pela exposição do gel seco a um filme de raios-X. </li></ol> Para RNA ribossomal <ol start="4"><li> Adicionar 190 mL de solução de 2 mM etilenodiaminotetracetato (EDTA) preparado com água tratada DEPC-, e 200 mL de fenol equilibrado com a água, a 10 mL de uma suspensão de esferas. Misture a suspensão, por vórtex vigoroso e separar a fase inorgânica da fase orgânica por centrifugação a 10.000 xg por 3 min à temperatura ambiente. Coletar a camada de água superior em um microtubo novo. </li><li> Precipitar o RNA a partir da camada de água, adicionando volume 1 / 10 de acetato de sódio 3 M, pH 5.2, 1 mL de 20 mg / mL de solução de glicogênio, e 2 volumes de etanol gelado. Ressuspender o RNA em 10 mL de água tratada DEPC-. </li><li> Verificar a integridade dos RNAs ribossomais por eletroforese em gel de agarose. Normalmente, 50 mL de suspensão contas rendimentos 1μg de RNA ribossômico. </li></ol> 7. Resultados representativos: A Figura 2 apresenta os resultados de uma série de análises a avaliação da qualidade e funcionalidade dos ribossomos traduzindo isolado usando o procedimento descrito. A observação de uma banda única resolvidos em géis de poliacrilamida indica a presença de polipeptídeos ligados ao mRNAs biotina marcado ligado ao SMB (Figura 2A). A purificação de RNAs ribossomais usando este procedimento estabelece a presença de ribossomos ligados a estes mRNAs biotina-rotulados, também (Figura 2B). Além de puromicina, um antibiótico que induz a atividade de peptidil-transferase do ribossomo, resulta na clivagem da nascente peptidil-tRNAs 1. Isto é observado como uma mudança no padrão de migração do polipeptídeo isolado em gel de poliacrilamida (Fig. 2C). Juntos, esses dados indicam que a biotina marcada com mRNAs anexado ao SMB contêm ribossomos funcionais com peptidil-tRNAs. O isolamento dos ribossomos traduzindo contendo específicas peptidil-tRNAs permite o estudo dos efeitos da peptidil-tRNAs, antibióticos e outras moléculas, em função do ribossomo (Figura 3A), e sobre a estrutura do ribossomo (Figura 3B). Nos exemplos aqui apresentados sparsomycin o antibiótico eo aminoácido triptofano (Trp) inibir a clivagem hidrolítica do nascente tnaC-tRNA peptidil-tRNA induzida por RF2 nos ribossomos isolados (Figura 3A). A interação de sparsomycin ou Trp com o ribossoma também induz mudanças estruturais em alguns nucleotídeos que constituem o rRNA 23S do ribossomo traduz (Fig 3B). Em resumo, o material biológico obtido utilizando o procedimento descrito aqui são úteis na obtenção de entendimento adicional dos contatos estruturais envolvidos na inibição da função do ribossomo em cima de sua interação com vários fatores molecular. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Procedimento usado para produzir e purificar ribossomos traduzindo contendo peptidil-tRNAs. DNA fragmentos ca. 650 bp de comprimento, contendo o gene tnaC e sua região adjacente, mostrado na figura, são usados ​​como modelos na preparação de mRNAs que contém biotina, [(bio) UMP] mRNA. Estes fragmentos de DNA são produzidos por PCR usando os procedimentos oligodeoxynucleotides indicado na parte superior da figura. Letras sublinhadas marcar a localização do promotor T7 codificada na cartilha de nucleotídeos. Letras em negrito indicam a seqüência Equipamento para engraxar os Dalgarno que é usado na tradução das seqüências de mRNA tnaC. O promotor T7 no fragmento de DNA é reconhecido por T7 RNA polimerase, que é usado para transcrever (seta) a seqüência tnaC ea jusante não-codificantes seqüência. Transcrição termina quando a RNA polimerase chega ao fim 3'-do fragmento de DNA, depois de as seqüências rpoBC terminator (rpoBC "t"). A estrutura do haste-laço do terminator rpoBC protege o mRNA da 3'-5 apresentam atividade "exoribonuclease nos extratos livres de células utilizadas na tradução em reações in vitro. O isolado [(bio) UMP] mRNAs são usados ​​para gerar parado, ribossomos traduzindo, usando tradução em ensaios in vitro. A seqüência tnaC no [(bio) UMP] mRNA é traduzida por um ribossomo que barracas, quando o último aminoácido é incorporada, devido à ausência do Fator de Liberação (RF2) a partir da mistura de reação. O ribossomo-[(bio) UMP] complexos mRNA são isolados a partir da mistura de reação total com estreptavidina-magnético-beads (SMB) que se ligam a biotina marcada com nucleotídeos incorporados no mRNA. O SMBs ligado ao ribossomo-[(bio) UMP] complexos mRNA são extraídos da mistura de reação total usando um campo magnético (MF). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análises estruturais e funcionais dos complexos isolados. A) Nas reações de tradução in vitro foram realizados com [(bio) UMP] mRNAs em que o códon de iniciação do gene tnaC foi substituído por um códon de parada. Os produtos finais foram isolados usando pérolas de estreptavidina, como é indicado na Figura 1. Produtos de reacção e moléculas isoladas foram então analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. O tnaC-tRNA e bandas tnaC peptídeo são marcados. B) Total RNA foi isolado a partir dos complexos parado utilizando procedimentos de extração fenol. Cada RNA isolado foi resolvido por eletroforese em gel de agarose. RNAs ribossomais (rRNAs) são indicados. C) complexos isolados contendo tnaC-tRNAs foram incubadas com (+) ou sem (-) 0,02 mM puromicina (Puro) em temperatura ambiente por 10 min. O peptídeo tnaC foram marcados durante a tradução usando [35S]-metionina (A) ou [3H]-prolina (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análises estrutural e funcional dos ribossomos contendo tnaC-tRNA que estão vinculados ao sparsomycin antibiótico, ou do aminoácido triptofano. A) complexos isolados contendo tnaC-tRNAs foram incubadas com (+) ou sem (-) sparsomycin (Spar) ou triptofano (Trp) em temperatura ambiente por 5 min. Mais tarde, as misturas foram misturados com RF2 e incubados a 37 ° C por 20 min. B) Análise das mudanças de metilação no 23S rRNA induzida por moléculas de adesão dentro do ribossomo. Complexos isolados foram pré-incubadas com (+) ou sem (-) 2 mM Trp ou Spar por 5 min a 37 ° C. Então, um agente de alquilação, sulfato de dimetilo, e foi adicionado a misturas incubadas em temperatura ambiente por um adicional de 20 min. RNA total foi extraído e ensaios de extensão de primer foram realizadas com [32P]-rotulados oligodeoxynucleotide complementares para os nucleotídeos do rRNA 23S, que são espaçados 100 nucleotídeos a jusante do nucleotídeo modificado. Os produtos finais dos ensaios de extensão foram resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida. Os nucleotídeos 23S rRNA afetada pela presença de Trp ou Spar são indicados.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este procedimento de isolamento descritas neste relatório é altamente reprodutível. Infelizmente, a presença de curto peptidil-tRNAs produzido a partir de seqüências de mesmo traduzido não pode ser convenientemente evitada; tais peptidil-tRNAs podem corresponder a 15-20% do material total isolada (Figura 2C). Estes contaminantes podem aumentar em concentração quando maiores concentrações de mRNA biotina-rotulados foram usadas ou quando os extratos de células livres usados ​​são antigos ou que tenham sido re-utilizado várias vezes. Portanto, é muito importante para controlar a qualidade e concentração dos componentes da tradução em reações in vitro. Alternativamente, alta eficiência comercial reconstituído livre de células extratos estão disponíveis, que podem ser utilizados para os mesmos fins (sistema PURE) 18. Usando este método, biotina-16-UMP é incorporado aleatoriamente ao longo do comprimento do mRNA alvo. Há uma possibilidade de que alguns ORFs contendo uridina tratos podem ter incorporado este nucleotídeo modificado em suas seqüências, afetando a sua tradução. Variável concentrações relativas de biotin-16-UTP/UTP têm de ser testados durante a síntese do mRNA, a fim de obter a tradução mais eficiente. Métodos alternativos de rotulagem biotina pode ser usado, visando o 5&#39;-final, final mais estável do mRNAs. (I) A biotina pode ser ligado à extremidade 5&#39;-do mRNA usando 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, trifosfato de 3&#39;-desoxiadenosina) e T4 RNA ligase 19. (Ii) 5&#39;-end biotina marcada com oligonucleotídeo pode ser ligado à extremidade 5&#39;-do mRNA usando RNA ligase T4 bem 20. (Iii) 3&#39;-end biotina-rotulados oligodeoxynucleotides que correspondem à seqüência complementar no final 5&#39;-do mRNA também poderia ser usado para isolar os complexos de tradução. Estes oligodeoxynucleotides biotina marcada poderia ser anexado ao SMB antes de isolamento. Mais tarde, o SMB ligado à biotina-rotulados oligodeoxynucleotides poderia ser misturado com a mistura de reação de tradução para permitir a interação com suas seqüências de mRNA complementar. Após o isolamento, a região RNA-DNA híbrido - e na região hibridação entre o oligodeoxynucleotide biotina marcado ea seqüência de mRNA - poderiam ser degradadas com RNAse H, separando os complexos parado dos grânulos estreptavidina. Este método alternativo pode permitir que os complexos a ser empregada, no futuro, análises estruturais usando métodos de resolução mais alta.

<table><tbody><tr><td>Base de Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnésio</td><td>Fluka</td><td>63049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Fluka</td><td>09688</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Contas de suspensão de sefarose proteína A 4B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor leupeptina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9783</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase Taq-DNA</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Kit T7 Maxiprep</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>SMB</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-16-UTP</td><td>Roche Group</td><td>1388908</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7002</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7768</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 8000</td><td>Fluka</td><td>81268</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Fluka</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Fluka</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>tRNA de &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5816</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos L-amino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Suportes magnéticos para separação</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de ribossomos traduzindo contendo peptidil-trnas para análises funcionais e estruturais

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recentemente, estudos estruturais e bioquímicos têm detalhada muitos dos eventos moleculares que ocorrem no ribossomo durante a inibição da síntese proteica por antibióticos e, durante a síntese de polipeptídeos nascentes. Alguns destes antibióticos, e regulamentar polipeptídeos nascentes principalmente na forma de peptidil-tRNAs, inibem ou formação da ligação peptídica ou término de tradução 1-7. Estes eventos inibitória pode parar o movimento do ribossomo, um fenômeno denominado &quot;prisão de translação&quot;. Prisão tradução induzida por qualquer um antibiótico ou um polipeptídeo nascente foi mostrado para regular a expressão de genes envolvidos em diversas funções celulares, como crescimento celular, a resistência aos antibióticos, a translocação de proteínas e metabolismo celular 8-13. Conhecimento de como antibióticos e regulamentares polipeptídeos nascentes alterar a função do ribossomo é essencial se quisermos compreender o papel completo do ribossoma na tradução, em cada organismo. Aqui, descrevemos uma metodologia simples que podem ser usados ​​para purificar, exclusivamente, para análise, os ribossomos traduzindo um mRNA específico e contendo um determinado peptidil-tRNA 14. Este procedimento é baseado no isolamento seletivo de ribossomos traduzindo vinculado a um mRNA biotina-rotulados. Estes complexos de translação são separados dos ribossomos outros na mesma mistura, usando pérolas paramagnética estreptavidina (SMB) e um campo magnético (MF). MRNAs biotina-rotulados são sintetizados por ensaios de run-off de transcrição usando como modelos de fragmentos de PCR gerado DNA que contêm promotores T7 transcricional. T7 RNA polimerase incorpora biotina-16-UMP de biotina-UTP; nas nossas condições aproximadamente dez biotina-16-UMP moléculas são incorporadas em um mRNA nt 600 com um teor UMP 25%. Estes biotina-rotulados mRNAs são então isolados, e utilizado em ensaios in vitro realizados com tradução fator de liberação de 2 (RF2) estão esgotados livre de células extratos obtidos a partir de cepas de Escherichia coli contendo o tipo selvagem ou mutante ribossomos. Ribossomos traduzindo a biotina marcada com seqüências de mRNA estão paralisadas na região códon de parada, devido à ausência da proteína RF2, que normalmente realiza encerramento de tradução. Ribossomos parado contendo o recém-sintetizado peptidil-tRNA são isolados e removidos a partir de reações de tradução usando SMB e um MF. Estas contas só ligar biotina contendo mensagens. Os isolados, complexos de translação, pode ser usado para analisar as características estruturais e funcionais do tipo selvagem ou mutante componentes ribossomal, ou peptidil-tRNA seqüências, bem como determinar a interação ribossomo com antibióticos ou outros fatores moleculares 1,14-16. Para examinar a função desses complexos isolados ribossomo, peptidil-transferase ensaios podem ser realizados na presença do antibiótico puromicina 1. Para estudar as mudanças estruturais em complexos de translação, procedimentos bem estabelecidos podem ser utilizados, tais como i) crosslinking a 14 aminoácidos específicos e / ou ii) ensaios alquilação proteção 1,14,17.

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Recentemente, estudos estruturais e bioquímicos detalharam muitos dos eventos moleculares que ocorrem no ribossomo durante a inibição da síntese proteica...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar a estrutura e a função de ribossomos puros contendo um RNAt peptídico único. Isso é conseguido realizando ensaios de tradução in vitro com extratos livres de células esgotados de fatores de liberação e RNAm marcados com biotina, para gerar complexos ribossomais com RNAt peptídico estagnado, ligados aos RNAm marcados com biotina. Como segundo passo, esferas paramagnéticas ligadas à estreptavidina são misturadas aos ensaios de tradução in vitro para permitir sua interação com as moléculas de biotina localizadas no RNAm.Posteriormente, as microesferas são extraídas utilizando campos magnéticos, que puxam os complexos de ribossomos com peptidil-tRNA estacionados ligados aos RNAm, separando-os da reação total. Em seguida, os complexos de ribossomos com peptidil-tRNA purificados podem ser misturados com fatores de tradução, como fatores de liberação, antibióticos inibidores ou agentes químicos modificadores, com o objetivo de analisar sua função. São obtidos resultados sobre inibição e estrutura do ribossomo, que demonstram a inibição da hidrólise dos peptidil-tRNAs e sua correlação com alterações estruturais nos ribossomos, com base em ensaios de atividade da peptidil transferase ou de terminação da tradução em géis SDS ou Tris Racine page e ensaios de proteção contra modificações em géis ureia page.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a centrifugação diferencial, é que as amostras isoladas contêm principalmente ribossomos com apenas uma população de tRNA pep. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da expressão gênica, como a natureza dos polipeptídeos nascentes e como os antibióticos afetam a função do ribossomo, por exemplo, modulando o processo de tradução. Para iniciar este procedimento, obtenha dois gramas de um pellet bacteriano seco de E. coli proveniente de culturas na fase log.Lave o pellet ressuspendendo-o em um litro de tampão, seguido por centrifugação a 5.000 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após realizar duas lavagens, ressuspenda o pellet bacteriano resultante em 40 mililitros de tampão e rompa as células bacterianas utilizando um prensa francesa com pressão de 6.000 PSI. Essa pressão corresponde a 600 unidades usando um pistão de uma polegada.Colete a suspensão disruptada em um tubo de vidro limpo de 50 mililitros. Trate a suspensão disruptada com DIO triol ou DTT a um milimolar e centrifugue a amostra a 30.000 ×g por 30 minutos. Remova o sobrenadante resultante e repita o procedimento de centrifugação.Guarde o sobrenadante obtido da segunda centrifugação, distribua o sobrenadante final em microtubos. Por fim, congele rapidamente as alíquotas utilizando uma mistura de gelo seco e etanol ou nitrogênio líquido e armazene as amostras a menos 60 ou menos 80 graus Celsius.Inicie a preparação de extratos livres de células desprovidos de RF dois misturando 4,5 mililitros de suspensão de esferas de proteína A quatro B com cinco mililitros de um antissoro anti-RF dois. Incube a mistura em rotação numa roda rotativa à temperatura ambiente por uma hora. Centrifugue a mistura a 2.500 ×g para separar as esferas do antissoro.Descarte o sobrenadante. As esferas agora contêm os dois anticorpos anti RF e serão denominadas esferas anti RF. Lave as esferas ressuspendendo-as em um mililitro do tampão B.Em seguida, centrifugue as microesferas como antes para separar as microesferas antirrf2 do tampão B. Repita este procedimento de lavagem duas vezes. Após a lavagem das microesferas, misture um mililitro do extrato livre de células com 150 microlitros de microesferas antirrf2 e incube em rotação a quatro graus Celsius por duas horas. Após a incubação, centrifugue a mistura a 10.000 ×g para separar o extrato livre de células das microesferas.Remova o sobrenadante e trate novamente com outros 150 microlitros de anticorpo anti RF dois ligado a microesferas antes de repetir a incubação e a precipitação mais uma vez. Distribua a solução final de extrato livre de células esgotado de RF dois em tubos microcentrífuga, com 100 microlitros por tubo. Congele as alíquotas utilizando uma mistura de gelo seco e etanol ou nitrogênio líquido e armazene a menos 60 ou menos 80 graus Celsius.Prepare a reação de PCR combinando o modelo de plasmídeo contendo as sequências a serem traduzidas, oligodesoxinucleotídeos, DTPs, DNA polimerase intacta e tampão de PCR estratégico. Uma vez que a amostra de PCR tenha sido preparada, realize a reação de amplificação e precipite o DNA para purificar os produtos de PCR pela adição de um décimo do volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,2, e dois volumes de etanol gelado. Após repetir o procedimento de precipitação mais uma vez, suspendemos o DNA resultante em 100 microlitros de água tratada com diclorodimetil-hidantoína ou água tratada com dióxido de cloro.Verifique a integridade dos produtos de PCR por eletroforese em géis de agarose. Normalmente, este procedimento produz 100 microgramas de um produto de DNA de 600 pares de bases. Prepare uma reação de transcrição in vitro de 100 microlitros em água tratada com DEPC misturando cinco microgramas do fragmento de DNA gerado por PCR com ribonucleotídeos marcados com UTP biotinilado e mistura enzimática T7.Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por três horas. Para quantificar a quantidade de mRNA obtida, elimine o molde de DNA adicionando DNase livre de RNA. Incube a reação a 37 graus Celsius por 10 minutos.Para purificar os produtos de mRNA, precipite o RNA duas vezes adicionando um décimo de volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,2, e dois volumes de etanol frio; depois, re-suspenda o mRNA precipitado em 100 microlitros de água tratada com DPcI. Verifique a integridade dos produtos de mRNA marcados com biotina por eletroforese em géis Aros. Geralmente, este procedimento fornece entre um e dois miligramas de um produto de mRNA marcado com biotina de 600 nucleotídeos, para iniciar o isolamento de ribossomos em tradução contendo um peptid tRNA. Uma mistura de reação de tradução in vitro de 500 microlitros é preparada em água tratada com DEY.Primeiro, prepare a mistura reacional tamponada descrita no protocolo escrito em anexo e, em seguida, adicione 75 M de cada um dos aminoácidos, exceto aquele que será substituído por um aminoácido radioativo. Em seguida, adicione 20 a 50 microlitros do extrato livre de células RF dois esgotado à solução tampão contendo os aminoácidos. Incube a mistura por cinco minutos à temperatura ambiente para permitir a ativação dos ribossomos.Uma vez que os ribossomos tenham sido ativados, adicione 10 a 15 microgramas de RNAs mensageiros marcados com biotina à amostra. Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por 10 minutos.Enquanto isso, prepare três mililitros de esferas paramagnéticas de estreptavidina ou SMB no tampão C. Após a incubação, adicione a suspensão de SMP à mistura da reação de tradução. Incube a nova suspensão à temperatura ambiente por 10 minutos. Separe o SMB da mistura aplicando um campo magnético utilizando suportes magnéticos para separação. Resus.Suspenda o SMB no tampão C e separe as esferas novamente utilizando o suporte magnético. Após repetir este procedimento de lavagem duas vezes, re-suspenda as esferas em 500 microlitros de tampão C. Mantenha a suspensão no gelo e realize o próximo procedimento imediatamente. Para visualizar o peptid tRNA, misture 10 microlitros do SMB suspenso em tampão C com 10 microlitros de tampão de carga e separe os componentes ligados às esferas executando as amostras em géis de poliacrilamida de Tris-tric a 10%.Seque os géis utilizando um secador de géis a vácuo. Em seguida, verifique a integridade e a purificação do TRNA peptídico expondo o gel seco a um filme de raios X. Para analisar o RNA ribossômico, combine 190 microlitros de uma solução de EDTA dois milimolar preparada com água tratada com dpci, 200 microlitros de fenol equilibrado com água e 10 microlitros de uma suspensão de microesferas.Agite vigorosamente a suspensão resultante em vórtex. Separe a fase inorgânica da fase orgânica por centrifugação a 10.000 Gs durante três minutos. À temperatura ambiente, colete a camada aquosa superior em um novo tubo microcêntrifuga, precipite o RNA da camada aquosa adicionando um décimo do volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,21, 1 microlitro de solução de glicogênio a 20 miligramas por mililitro e dois volumes de etanol gelado. Re-suspenda o RNA precipitado em 10 microlitros de água tratada com dpcI.Verifique a integridade dos RNAs ribossômicos por eletroforese em géis de niro. Geralmente, 50 microlitros de suspensão de batida produzem um micrograma de RNA ribossômico. Aqui são apresentados os resultados de uma série de análises que avaliam a qualidade e a funcionalidade dos ribossomos tradutores isolados.A observação de uma banda única resolvida em géis de poliacrilamida indica a presença de polipeptídeos ligados aos RNAm marcados com biotina, associados ao SMB. A purificação dos RNAs ribossomais. O uso deste procedimento também comprova a presença de ribossomos ligados a esses RNAm marcados com biotina.A adição da puromicina, um antibiótico que induz a atividade peptidil transferase do ribossomo, resulta na clivagem dos peptidil-tRNAs em formação. Isso é observado como uma alteração no padrão de migração do polipeptídeo isolado em géis de poliacrilamida. Conjuntamente, esses dados indicam que os RNAs mensageiros marcados com biotina ligados ao SMB contêm ribossomos funcionais com peptidil-tRNAs.O isolamento de ribossomos em tradução contendo RNAts peptidil específicos permite o estudo dos efeitos de RNAts peptidil, antibióticos e outras moléculas sobre a função e a estrutura ribossomal. Nos exemplos apresentados aqui, o antibiótico s parsamyn e o aminoácido triptofano inibem a clivagem hidrolítica do RNAt peptidil TNAC nascente pelo RF dois nos ribossomos isolados.A interação do triptofano ou da esparamicina com o ribossomo também induz alterações estruturais em alguns nucleotídeos que compõem o 23 S-R-R-N-A do ribossomo em tradução. Uma vez dominada, a parte principal desta técnica pode ser realizada em cinco horas se for executada corretamente seguindo estes procedimentos. Outros métodos, como a criomicroscopia eletrônica, podem ser realizados para análises estruturais adicionais, a fim de responder perguntas complementares sobre a estrutura do ribossomo contendo Pepin, RNA, exclusivo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Uma técnica para identificar locais de pausa de translação sobre mRNA é descrito. Este procedimento é baseado no isolamento de polipéptidos nascentes que se acumulam nos ribossomas durante in vitro tradução de um ARNm alvo, seguido de análise de tamanho das cadeias nascentes utilizando uma electroforese em gel de desnaturação.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

Descrevemos aqui uma técnica que é rotineiramente usado para isolar estavelmente ligados ribossomo complexos da cadeia nascente (RNC). Esta técnica aproveita a descoberta de que um jovem de 17 aminoácidos longo SECM "seqüência de prisão" pode parar de alongamento de tradução em uma procariótica...

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.

Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

A Purificação de Afinidade de Ribosssomos Traduzível (TRAP) é capaz de capturar a tradução específica do tipo de célula do mRNA. Aqui relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado ao isolamento de mRNA em populações de células raras de embriões de Drosophila.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

Aprenda a isolar ribossomos contendo peptidil-tRNAs específicos usando extração magnética com mRNAs biotinilados. Este método avança estudos de função e estrutura ribossomal em biologia molecular.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

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