Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar a estrutura e a função de ribossomos puros contendo um RNAt peptídico único. Isso é conseguido realizando ensaios de tradução in vitro com extratos livres de células esgotados de fatores de liberação e RNAm marcados com biotina, para gerar complexos ribossomais com RNAt peptídico estagnado, ligados aos RNAm marcados com biotina. Como segundo passo, esferas paramagnéticas ligadas à estreptavidina são misturadas aos ensaios de tradução in vitro para permitir sua interação com as moléculas de biotina localizadas no RNAm.

Posteriormente, as microesferas são extraídas utilizando campos magnéticos, que puxam os complexos de ribossomos com peptidil-tRNA estacionados ligados aos RNAm, separando-os da reação total. Em seguida, os complexos de ribossomos com peptidil-tRNA purificados podem ser misturados com fatores de tradução, como fatores de liberação, antibióticos inibidores ou agentes químicos modificadores, com o objetivo de analisar sua função. São obtidos resultados sobre inibição e estrutura do ribossomo, que demonstram a inibição da hidrólise dos peptidil-tRNAs e sua correlação com alterações estruturais nos ribossomos, com base em ensaios de atividade da peptidil transferase ou de terminação da tradução em géis SDS ou Tris Racine page e ensaios de proteção contra modificações em géis ureia page.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a centrifugação diferencial, é que as amostras isoladas contêm principalmente ribossomos com apenas uma população de tRNA pep. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da expressão gênica, como a natureza dos polipeptídeos nascentes e como os antibióticos afetam a função do ribossomo, por exemplo, modulando o processo de tradução. Para iniciar este procedimento, obtenha dois gramas de um pellet bacteriano seco de E. coli proveniente de culturas na fase log.

Lave o pellet ressuspendendo-o em um litro de tampão, seguido por centrifugação a 5.000 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após realizar duas lavagens, ressuspenda o pellet bacteriano resultante em 40 mililitros de tampão e rompa as células bacterianas utilizando um prensa francesa com pressão de 6.000 PSI. Essa pressão corresponde a 600 unidades usando um pistão de uma polegada.

Colete a suspensão disruptada em um tubo de vidro limpo de 50 mililitros. Trate a suspensão disruptada com DIO triol ou DTT a um milimolar e centrifugue a amostra a 30.000 ×g por 30 minutos. Remova o sobrenadante resultante e repita o procedimento de centrifugação.

Guarde o sobrenadante obtido da segunda centrifugação, distribua o sobrenadante final em microtubos. Por fim, congele rapidamente as alíquotas utilizando uma mistura de gelo seco e etanol ou nitrogênio líquido e armazene as amostras a menos 60 ou menos 80 graus Celsius.

Inicie a preparação de extratos livres de células desprovidos de RF dois misturando 4,5 mililitros de suspensão de esferas de proteína A quatro B com cinco mililitros de um antissoro anti-RF dois. Incube a mistura em rotação numa roda rotativa à temperatura ambiente por uma hora. Centrifugue a mistura a 2.500 ×g para separar as esferas do antissoro.

Descarte o sobrenadante. As esferas agora contêm os dois anticorpos anti RF e serão denominadas esferas anti RF. Lave as esferas ressuspendendo-as em um mililitro do tampão B.

Em seguida, centrifugue as microesferas como antes para separar as microesferas antirrf2 do tampão B. Repita este procedimento de lavagem duas vezes. Após a lavagem das microesferas, misture um mililitro do extrato livre de células com 150 microlitros de microesferas antirrf2 e incube em rotação a quatro graus Celsius por duas horas. Após a incubação, centrifugue a mistura a 10.000 ×g para separar o extrato livre de células das microesferas.

Remova o sobrenadante e trate novamente com outros 150 microlitros de anticorpo anti RF dois ligado a microesferas antes de repetir a incubação e a precipitação mais uma vez. Distribua a solução final de extrato livre de células esgotado de RF dois em tubos microcentrífuga, com 100 microlitros por tubo. Congele as alíquotas utilizando uma mistura de gelo seco e etanol ou nitrogênio líquido e armazene a menos 60 ou menos 80 graus Celsius.

Prepare a reação de PCR combinando o modelo de plasmídeo contendo as sequências a serem traduzidas, oligodesoxinucleotídeos, DTPs, DNA polimerase intacta e tampão de PCR estratégico. Uma vez que a amostra de PCR tenha sido preparada, realize a reação de amplificação e precipite o DNA para purificar os produtos de PCR pela adição de um décimo do volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,2, e dois volumes de etanol gelado. Após repetir o procedimento de precipitação mais uma vez, suspendemos o DNA resultante em 100 microlitros de água tratada com diclorodimetil-hidantoína ou água tratada com dióxido de cloro.

Verifique a integridade dos produtos de PCR por eletroforese em géis de agarose. Normalmente, este procedimento produz 100 microgramas de um produto de DNA de 600 pares de bases. Prepare uma reação de transcrição in vitro de 100 microlitros em água tratada com DEPC misturando cinco microgramas do fragmento de DNA gerado por PCR com ribonucleotídeos marcados com UTP biotinilado e mistura enzimática T7.

Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por três horas. Para quantificar a quantidade de mRNA obtida, elimine o molde de DNA adicionando DNase livre de RNA. Incube a reação a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Para purificar os produtos de mRNA, precipite o RNA duas vezes adicionando um décimo de volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,2, e dois volumes de etanol frio; depois, re-suspenda o mRNA precipitado em 100 microlitros de água tratada com DPcI. Verifique a integridade dos produtos de mRNA marcados com biotina por eletroforese em géis Aros. Geralmente, este procedimento fornece entre um e dois miligramas de um produto de mRNA marcado com biotina de 600 nucleotídeos, para iniciar o isolamento de ribossomos em tradução contendo um peptid tRNA. Uma mistura de reação de tradução in vitro de 500 microlitros é preparada em água tratada com DEY.

Primeiro, prepare a mistura reacional tamponada descrita no protocolo escrito em anexo e, em seguida, adicione 75 M de cada um dos aminoácidos, exceto aquele que será substituído por um aminoácido radioativo. Em seguida, adicione 20 a 50 microlitros do extrato livre de células RF dois esgotado à solução tampão contendo os aminoácidos. Incube a mistura por cinco minutos à temperatura ambiente para permitir a ativação dos ribossomos.

Uma vez que os ribossomos tenham sido ativados, adicione 10 a 15 microgramas de RNAs mensageiros marcados com biotina à amostra. Incube a mistura de reação a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Enquanto isso, prepare três mililitros de esferas paramagnéticas de estreptavidina ou SMB no tampão C. Após a incubação, adicione a suspensão de SMP à mistura da reação de tradução. Incube a nova suspensão à temperatura ambiente por 10 minutos. Separe o SMB da mistura aplicando um campo magnético utilizando suportes magnéticos para separação. Resus.

Suspenda o SMB no tampão C e separe as esferas novamente utilizando o suporte magnético. Após repetir este procedimento de lavagem duas vezes, re-suspenda as esferas em 500 microlitros de tampão C. Mantenha a suspensão no gelo e realize o próximo procedimento imediatamente. Para visualizar o peptid tRNA, misture 10 microlitros do SMB suspenso em tampão C com 10 microlitros de tampão de carga e separe os componentes ligados às esferas executando as amostras em géis de poliacrilamida de Tris-tric a 10%.

Seque os géis utilizando um secador de géis a vácuo. Em seguida, verifique a integridade e a purificação do TRNA peptídico expondo o gel seco a um filme de raios X. Para analisar o RNA ribossômico, combine 190 microlitros de uma solução de EDTA dois milimolar preparada com água tratada com dpci, 200 microlitros de fenol equilibrado com água e 10 microlitros de uma suspensão de microesferas.

Agite vigorosamente a suspensão resultante em vórtex. Separe a fase inorgânica da fase orgânica por centrifugação a 10.000 Gs durante três minutos. À temperatura ambiente, colete a camada aquosa superior em um novo tubo microcêntrifuga, precipite o RNA da camada aquosa adicionando um décimo do volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,21, 1 microlitro de solução de glicogênio a 20 miligramas por mililitro e dois volumes de etanol gelado. Re-suspenda o RNA precipitado em 10 microlitros de água tratada com dpcI.

Verifique a integridade dos RNAs ribossômicos por eletroforese em géis de niro. Geralmente, 50 microlitros de suspensão de batida produzem um micrograma de RNA ribossômico. Aqui são apresentados os resultados de uma série de análises que avaliam a qualidade e a funcionalidade dos ribossomos tradutores isolados.

A observação de uma banda única resolvida em géis de poliacrilamida indica a presença de polipeptídeos ligados aos RNAm marcados com biotina, associados ao SMB. A purificação dos RNAs ribossomais. O uso deste procedimento também comprova a presença de ribossomos ligados a esses RNAm marcados com biotina.

A adição da puromicina, um antibiótico que induz a atividade peptidil transferase do ribossomo, resulta na clivagem dos peptidil-tRNAs em formação. Isso é observado como uma alteração no padrão de migração do polipeptídeo isolado em géis de poliacrilamida. Conjuntamente, esses dados indicam que os RNAs mensageiros marcados com biotina ligados ao SMB contêm ribossomos funcionais com peptidil-tRNAs.

O isolamento de ribossomos em tradução contendo RNAts peptidil específicos permite o estudo dos efeitos de RNAts peptidil, antibióticos e outras moléculas sobre a função e a estrutura ribossomal. Nos exemplos apresentados aqui, o antibiótico s parsamyn e o aminoácido triptofano inibem a clivagem hidrolítica do RNAt peptidil TNAC nascente pelo RF dois nos ribossomos isolados.

A interação do triptofano ou da esparamicina com o ribossomo também induz alterações estruturais em alguns nucleotídeos que compõem o 23 S-R-R-N-A do ribossomo em tradução. Uma vez dominada, a parte principal desta técnica pode ser realizada em cinco horas se for executada corretamente seguindo estes procedimentos. Outros métodos, como a criomicroscopia eletrônica, podem ser realizados para análises estruturais adicionais, a fim de responder perguntas complementares sobre a estrutura do ribossomo contendo Pepin, RNA, exclusivo.