Isolamento Islet murino de pâncreas
22 de agosto de 2007
Olá, sou Greg Zott. Estou com o UCSF Diabetes Center no Bluestone Laboratory, e hoje vou mostrar a vocês o processo de isolamento de ilhós de camundongos. O procedimento envolve a injeção de uma solução de colagenase no pâncreas de um camundongo doador C3 H, onde removeremos esse pâncreas, digeriremos
Antes de iniciarmos este procedimento, diluímos nossa solução de ATE em um tampão Hanks modificado e ajustamos a concentração específica para a cepa de camundongo que estamos usando o C3 H. Encontramos digestores melhores em uma solução de colagenase de 0,8 mg por mil, e usaremos isso para injetar no ducto biliar comum para distender o pâncreas. Executar. O procedimento de hoje será Pavo codre do centro de diabetes. Ele injetará, abrirá o camundongo, exporá os intestinos e depois injetará no ducto biliar comum.
Vamos borrifar o mouse com etanol para manter o cabelo solto e, em seguida, também verificaremos se o mouse foi sacrificado adequadamente com uma pitada no dedo do pé. Pavo agora abrirá o camundongo e exporá o intestino e o pâncreas com uma incisão na linha média. O diafragma também será cortado para verificar se o mouse será sacrificado.
Antes de começarmos, gostaria de apontar algumas das estruturas importantes. O estômago está bem aqui com o pâncreas preso embaixo do duodeno e acima. Este é o fígado onde encontraremos a vesícula biliar e o ducto biliar comum, que você pode ver aqui.
Então, o que Pavo fará a seguir é isolar o intestino delgado, descobrir onde o ducto biliar comum entra no intestino delgado. Uma vez que o intestino é exposto, nós clampeamos em ambos os lados do ducto colédoco com grampos de mosquito. Descobrimos que isso permite que mais colágenos entrem no pâncreas, enquanto outros grupos tentam direcionar a pinça para cima do ducto biliar comum.
Descobrimos que esta é uma técnica melhor para permitir que a enzima entre no pâncreas. Este é um procedimento suave. Você não quer rasgar o intestino.
Você deseja permitir que os grampos fiquem suavemente em ambos os lados do ducto biliar comum. Agora encontraremos uma vesícula biliar e, uma vez que a vesícula biliar esteja exposta, usaremos isso como um guia para injetar a colagenase no ducto biliar comum. Powell está usando uma agulha de calibre 30 com uma seringa de cinco cc contendo três moinhos de solução de colagenase.
Quando ele está entrando no ducto biliar comum, ele está distendendo esse ducto com solução de colagenase e então ele viaja pelo ducto biliar comum até chegar perto do intestino. E enquanto ele está descendo, as soluções enzimáticas sendo bombeadas para o injetado no pâncreas. Agora que o pâncreas está inflado com solução de colagenase, Powell vai remover os hemostáticos e, em seguida, remover o pâncreas do camundongo, arrancando-o cuidadosamente do intestino.
Ele o remove do estômago. Ok, e então usando o baço como alça, ele levanta o pâncreas e depois o corta lentamente no ducto biliar comum, e é isso. O pâncreas é colocado para fora e, em seguida, o baço é removido, e lá ele está removendo o tecido meso entérico, e então o pâncreas é colocado em uma solução de colagenase de dois moinhos e um frasco de vidro esterilizado e é colocado de volta no gelo.
O pâncreas isolado que colocamos nos frascos de vidro agora será colocado em banho-maria a 37 graus por aproximadamente 17 minutos. Nós os colocamos em um rack cônico de 50 mil para que eles não flutuem. Uma vez durante o banho, o cronômetro começa e a digestão começa.
Uma vez que o tempo de digestão é concluído, os frascos são removidos e, em seguida, são agitados e interrompidos suavemente. E uma vez que o tecido começa a desmoronar, o frasco é colocado no gelo. Uma tela estéril é colocada sobre um copo de 400 mil que contém tampão de lavagem.
O digestor do pâncreas é então cuidadosamente derramado sobre a tela no tampão de lavagem. Para fins de demonstração, o capô foi desligado e o vidro do capô foi levantado para que pudéssemos ver o que estamos fazendo. Uma vez que o digerido do pâncreas é despejado no copo, os frascos são enxaguados com o mesmo tampão de lavagem e o tampão de lavagem colocado sobre a tela.
Temos uma seringa cheia de tampão de lavagem. Usaremos isso para lavar o lenço à força através da tela. A ideia é liberar quaisquer ilhós soltos que não estejam presos à matriz, mas deixando as membranas e o tecido não digerido na tela.
E quando você termina de lavar um lenço de papel, é isso que você costuma ver no final do procedimento. O tecido do pâncreas que está no fundo do tubo agora será transferido para dois cônicos de 50 mil, e o tecido será lavado, o tecido será misturado uniformemente e depois distribuído uniformemente para que tenhamos um volume de pellet igual em cada tubo. O copo agora é enxaguado com mais tampão de lavagem.
As laterais são enxaguadas para que você obtenha todo o tecido que entrou no béquer novamente. Em seguida, é distribuído igualmente entre cada dois, ambos 50 mil. Os cônicos são completados com tampão de lavagem.
O tecido é invertido várias vezes e depois colocado em uma centrífuga. Esta é uma rodada rápida. A centrífuga pode atingir mil RPM e depois é desligada.
O tecido neste momento é muito S ilhós são muito sensíveis e você não quer compactá-los demais. Os tubos são removidos e faremos esta etapa de lavagem mais três vezes. Este é o fim da terceira lavagem.
Os componentes do tubo cônico de 50 mil são transferidos para o tubo cônico de 15 e centrífuga por mil RP M e depois parados. O supernat será removido e a primeira parte da chamada FI será iniciada. Estamos na etapa em que temos nosso digestão peletizada do pâncreas.
Vamos ressuspender esse tecido para que fique bom e solto para os pellets. Adicionaremos o primeiro gradiente de densidade, que é 1 1 0 8. Vamos adicionar cinco mils a cada tubo.
O pellet é então misturado completamente em cada um dos gradientes. É importante que você obtenha uma boa distribuição de tecido em seu gradiente mais pesado. Agora vamos colocar dois mils de densidade 1 0 9 6.
Em seguida, em cima disso, colocaremos dois mils de densidade 1 0 6 9 e, em seguida, em cima dessa densidade 1 0 3 7. É importante, enquanto você está colocando as densidades em camadas, que você não misture. Em seguida, todas as camadas foram adicionadas ao tubo.
E você pode ver que este é o topo de 1 1 0 8, o topo de 9 1 0 9 6, o topo de 1 0 6 9 e o topo de 1 0 3 7. E você pode ver que o tecido já está começando a se mover para sua densidade adequada, mesmo sem fusão centrista. Os gradientes fial são acelerados a 1800 RPM por 15 minutos e lembre-se de manter o freio desligado depois que os tubos forem removidos da centrífuga.
Você pode ver entre as camadas 0 0 9 6 e 0 0 7, há uma bela faixa de tecido de ilhós de Pablo. Agora removendo a camada 0 3 7 para remover quaisquer detritos de tecido e DNA que possam ter sido liberados durante o processamento. Usando uma pipeta de pastagem de plástico estéril, ele agora removerá a camada de ilhotas e as transferirá para uma cônica de 50 mil contendo 25 mils de tampão de lavagem.
Você quer fazer esta etapa rapidamente porque fol é tóxico para os ilhós. Na verdade, removemos toda a camada 0 6 9 e 0 9 6. Pavo corta a parte superior da pipeta de pastagem de plástico e a enxagua com tampão de lavagem.
Os ilhós são então centrifugados como centrífuga anteriormente. A centrífuga é levada a mil RPM e então paramos e aspiramos. Os ilhós sobrenadantes serão lavados três vezes com meios de lavagem.
Então, acabamos de concluir o processo de isolamento da pálpebra que levamos do digesto para o gradiente fol para os ilhós purificados após nossa terceira lavagem com tampão de lavagem, ressuspendemos os ilhós em nosso meio RPMI e o reproduzimos em uma placa de cultura de tecidos. Esses ilhós agora estão prontos para ensaios in vitro ou preparações in vivo, como transplante de ilhós.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra o processo de isolamento de ilhotas de camundongo a partir do pâncreas de um camundongo doador C3H. O procedimento inclui injeção de colagenase, remoção do pâncreas e purificação de ilhotas para transplante em um camundongo NOD diabético.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Endocrinologia
- Biologia do Transplante
Antecedentes
- O transplante de ilhotas é um tratamento potencial para o diabetes.
- O isolamento de ilhotas requer digestão enzimática específica.
- A colagenase é comumente usada para o isolamento de ilhotas.
- Modelos de camundongo são frequentemente utilizados na pesquisa sobre diabetes.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para o isolamento de ilhotas de camundongo.
- Preparar ilhotas para transplante em receptores diabéticos.
- Aprimorar a compreensão da função e viabilidade das ilhotas após o isolamento.
Métodos Utilizados
- Injeção de solução de colagenase no pâncreas.
- Remoção e digestão do pâncreas.
- Purificação de ilhotas pancreáticas usando um gradiente de Ficoll.
- Seleção manual de ilhotas pancreáticas para transplante.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de ilhotas a partir do pâncreas.
- As ilhotas preparadas para transplante mostraram viabilidade.
- O método demonstrou eficácia para estudos futuros.
- Potencial para melhorar o tratamento do diabetes por meio de transplante.
Conclusões
- O método descrito é eficiente para o isolamento de ilhotas de camundongo.
- O transplante de ilhotas pode ser uma opção viável para modelos diabéticos.
- Pesquisas futuras podem se basear nesta técnica de isolamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de ilhotas pancreáticas funcionais de modelos murinos permite a avaliação pré-clínica de terapêuticas para o diabetes e estratégias regenerativas. Esta técnica apoia a validação de alvos em doenças metabólicas, fornecendo um sistema relevante à doença para avaliar a secreção de insulina, viabilidade de enxertos e intervenções imunomoduladoras. Um rendimento confiável de ilhotas aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos promissores e na redução de riscos pré-clínicos para abordagens baseadas em transplante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas na homeostase da glicose e na função das células beta utilizando ilhotas murinas primárias.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte padronizada de tecido primário para estudos de engajamento de alvos e modulação de vias metabólicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece ilhotas purificadas adequadas para ensaios funcionais que medem a secreção de insulina e a viabilidade celular.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio da preparação consistente de tecidos e purificação em gradiente de densidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a avaliação da eficácia do transplante de ilhotas em modelos de camundongos NOD diabéticos.
- Valor Operacional: Permite a continuidade dos estudos desde o isolamento até o enxerto, apoiando a validação de modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta ao fornecer tecido primário validado para a validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e estudos pré-clínicos de transplante na pesquisa sobre diabetes.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a função das ilhotas, sua sobrevivência e resposta a imunomoduladores ou compostos regenerativos.
- Triagem: Permite o preparo reprodutível de ilhotas para leituras funcionais de alta fidelidade em cascatas de triagem de compostos.
- Análises: Gera resultados quantitativos, como liberação de insulina e métricas de viabilidade, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta o isolamento à validação pré-clínica por meio do transplante em receptores diabéticos, avaliando a função do enxerto e a tolerância imunológica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para gerar ilhotas relevantes para doenças em diversos programas terapêuticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos por meio de tecido primário relevante para a doença.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização no isolamento de ilhotas por meio da digestão com colagenase e purificação em gradiente de Ficoll.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao reduzir a incerteza biológica em modelos pré-clínicos de diabetes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de estratégias de transplante e regeneração com base na função de ilhotas validada.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cirurgia de camundongos e manipulação de tecidos para isolamento e digestão do pâncreas.
- Depende da preparação da solução de colagenase e da otimização da concentração para linhagens específicas de camundongos.
- Requer acesso a equipamentos de centrifugação para etapas de separação por gradiente de densidade e lavagem.
- Envolve considerações de adaptação para variações específicas da linhagem no tamanho do pâncreas e na eficiência da digestão.
- É limitado pela sensibilidade do tecido durante o processamento, exigindo manipulação cuidadosa para preservar a viabilidade e a função das ilhotas.
