Name: Isolamento Islet murino de pâncreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: Aprenda o isolamento de ilhotas pancreáticas de camundongos C3H usando colagenase e gradiente de Ficoll. Este método viabiliza transplantes para modelos diabéticos NOD e avança pesquisas em endocrinologia.

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Preparação colagenase <ol><li> Pesar a colagenase em um buffer de 50 ml de isolamento ml e juntar para fazer a concentração final, conforme indicado na tabela abaixo. Dissolver a colagenase em vortex. (12 + 2 ratos ratos extra = 14 ratos x 5 ml / mouse = 70 ml de solução de colagenase total) (70 ml x 0,5 mg / ml ou 0,3 mg / ml = 35 mg ou 21 mg de colagenase total P) <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Tensão </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Idade </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Colagenase P (mg / ml) </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Tempo (min) </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 semanas </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 semanas </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR, NÃO </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 semanas </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR, NÃO </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 semanas </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li> Dispense 2 ml de solução de colagenase em cada frasco de vidro e colocar no gelo. Carregar cada seringa de 5 ml com 3 ml de colagenase agulha 30g adicionar e coloque em gelo (preparar na capa). </li></ol> Distensão <ol><li> Pouco antes de dissecção, o sacrifício de animais por deslocamento cervical. Pulverizar o corpo inteiro com 70% de álcool etílico, tornando-o completamente molhado. Faça uma V-Insision começando na área genital. Girar o mouse para a cauda está enfrentando longe de você. </li><li> Retire do intestino para o lado esquerdo do mouse em aberto. Isto irá expor o pâncreas e do duto biliar comum. </li><li> Coloque uma pinça hemostática de cada lado do intestino delgado, onde o ducto biliar drenos, deixando uma pequena bolsa para solução de colagenase a entrar no intestino. </li><li> Inflar o pâncreas através do ducto biliar com uma agulha 30g e seringa de 5 ml contendo 3 ml de solução de colagenase frio, a partir da vesícula biliar. </li><li> Remover o pâncreas do corpo e colocá-lo em um frasco siliconizado contendo 2 ml de solução de colagenase. Esta etapa deve ser feito rapidamente e tão limpa quanto possível, minimizando coleção de gordura e tecido conjuntivo. </li><li> Coloque o frasco sobre o gelo e 3 repita o passo com o mouse que vem. </li></ol> Digestão <ol><li> Seal cada frasco e coloque-o a 37 ° C em banho-maria. Incubar durante 13-17 minutos (o tempo varia com a tensão ea idade do animal). </li><li> Após o tempo decorrido, agite o frasco vigorosamente. O pâncreas devem desmoronar. </li><li> Despeje cada digestão através de um filtro estéril, pia grande em um copo ml estéril 1000 e com força pipeta fora da tela com tampão de lavagem. Dispense o digere em tubos de 50 ml conicals (3 ml tubo pancreata/50: se n = 12, use o suficiente lavar buffer para fazer a final do volume 200 ml e fornecê-las para tubos 4x50 ml). A diluição deve ser feito rapidamente e com gelo para evitar a digestão das ilhotas indesejados. </li><li> Spin down: Iniciar a centrífuga. Quando se chega a 1300 rpm, desligá-lo. </li><li> Aspirar o sobrenadante, deixando ~ 5 mL. Tenha muito cuidado para não aspirar o sedimento. </li><li> Ressuspender pellet tocando vigorosamente com a mão, em seguida, adicione 50 ml de tampão de lavagem. </li><li> Spin down: Iniciar a centrífuga. Quando se chega a 1300 rpm, desligá-lo. </li><li> Ressuspender o sedimento e lavar com 5 ml de tampão de lavagem. </li><li> Transferir os 5 ml a 15 ml cônico e spin down, como acima. </li><li> Aspirar o sobrenadante forma mais completa possível. (Buffer restante pode causar a mudança de densidade do Ficoll). </li></ol> Ficoll Executar rapidamente. Exposição a longo prazo Ficoll é tóxico para ilhotas. <ol><li> Certifique-se de pellet é completamente quebrado antes de adicionar Ficoll (tecido intacto é difícil de ressuspender em Ficoll). </li><li> Ressuspender o sedimento em 7 ml de Ficoll, a densidade de 1,108, em vortex vigorosamente. </li><li> Camada em cima de cada densidade de Ficoll 2ml de cada uma das densidades restantes na seguinte ordem: 1,096, 1,069, 1,037, em seguida. </li><li> Giro por 15 minutos a 1800 rpm a 4 graus, com quebra OFF! </li><li> Escolha ilhotas da segunda camada utilizando spoid (p estérilconta-gotas lastic). Transferência de todas as coleções para um contendo 50 ml ~ cônico 25 mL de tampão frio. </li><li> Lavagem, como acima, 3 vezes com tampão de lavagem (repetindo a etapa 12-15). </li><li> Ilhotas ressuspender em 20 ml RPMI-1640 (contendo 10% SFB e penicilina e estreptomicina, HEPES, MEM-NEAA) e misture delicadamente. Retirar 100 ul de amostra para contagem. </li><li> Transferir 100 ul a 35 placa Grid-mm contendo 1 ml de mídia e um ditizona ml. </li><li> Incubar ilhotas restante em RPMI 1640, em um 37 ° C, 7% incubadora de CO 2, em 160 mm, com placas de um total de 30 ml de media / prato. <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="220" height="194" /></li></ol>

isolamento islet murino de pâncreas

Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolamento Islet murino de pâncreas

Olá, sou Greg Zott. Trabalho no Centro de Diabetes da UCSF, no Laboratório Bluestone, e hoje vou mostrar o processo de isolamento de ilhotas pancreáticas de camundongos. O procedimento envolve a injeção de uma solução de colagenase no pâncreas de um camundongo doador C3H, seguida pela remoção desse pâncreas, digestão do tecido, purificação das ilhotas em um gradiente de Ficoll, seleção manual das ilhotas e, por fim, transplante na cápsula renal de um camundongo NOD diabético, que será o receptor.Antes de iniciar este procedimento, diluímos nossa solução de ATE em um tampão Hanks modificado e ajustamos a concentração específica para a linhagem de camundongo que estamos utilizando, a C3H. Verificamos que a digestão é melhor com uma solução de colagenase a 0,8 mg por mL, e utilizaremos essa solução para injetar no ducto biliar comum a fim de distender o pâncreas. Realizando o procedimento hoje estará Pavo Codre do centro de diabetes. Ele fará a injeção, abrirá o camundongo, exporá os intestinos e, em seguida, injetará no ducto biliar comum.Vamos pulverizar o rato com etanol para manter os pelos achatados e, em seguida, também verificaremos se o rato foi sacrificado corretamente com um aperto no dedo da pata. Pavo agora abrirá o rato e exporá o intestino e o pâncreas com uma incisão mediana. O diafragma também será cortado para verificar se o rato foi sacrificado.Antes de começarmos, gostaria de destacar algumas das estruturas importantes. O estômago está localizado bem aqui, com o pâncreas aderido abaixo dele, indo até o duodeno e acima. Este é o fígado, onde encontraremos a vesícula biliar e o ducto biliar comum, que você pode ver bem aqui.O que Pavo fará em seguida é isolar o intestino delgado e localizar onde o ducto biliar comum entra no intestino delgado. Uma vez exposto o intestino, aplicamos grampos do tipo mosquito em ambos os lados do ducto biliar comum. Verificamos que isso permite que mais colagenases entrem no pâncreas, enquanto outros grupos tentam posicionar o grampo diretamente sobre o ducto biliar comum.Verificamos que esta é uma técnica melhor para permitir que a enzima entre no pâncreas. Este é um procedimento suave. Você não deseja romper o intestino.Você deve permitir que as pinças fiquem suavemente em ambos os lados do ducto biliar comum. Agora, localizaremos uma vesícula biliar e, uma vez exposta a vesícula biliar, usaremos essa estrutura como guia para injetar a colagenase no ducto biliar comum. Powell está usando uma agulha de 30 graus com uma seringa de cinco cc contendo três mililitros de solução de colagenase.À medida que ele entra no ducto biliar comum, ele dilata esse ducto com a solução de colagenase e, em seguida, desce pelo ducto biliar comum até se aproximar do intestino. E enquanto desce, a solução enzimática é bombeada e injetada no pâncreas. Agora que o pâncreas está inflado com a solução de colagenase, Powell vai remover os hemostatos e, então, remover o pâncreas do camundongo, separando-o cuidadosamente do intestino.Ele o remove do estômago. Ok, e então, usando o baço como alça, levanta o pâncreas e, lentamente, o secciona no ducto biliar comum, e é isso. O pâncreas é exposto e, em seguida, o baço é removido; ali ele está removendo o tecido mesentérico, e então o pâncreas é colocado em uma solução de colagenase 2 miligrama por mililitro em um frasco de vidro esterilizado e devolvido ao gelo.O pâncreas isolado que colocamos nos frascos de vidro será agora colocado em um banho-maria a 37 graus por aproximadamente 17 minutos. Colocamos os frascos em um suporte cônico de 50 mL para que não flutuem. Assim que o banho for iniciado, o cronômetro é acionado e a digestão começa.Após o tempo de digestão ser concluído, os frascos são removidos e, em seguida, agitados e disruptados suavemente. E quando o tecido começa a se desintegrar, o frasco é colocado sobre gelo. Uma tela estéril é colocada sobre um béquer de 400 mil que contém tampão de lavagem.O digesto de pâncreas é então cuidadosamente despejado sobre a peneira no tampão de lavagem. Para fins de demonstração, a cabine de segurança foi desligada e o vidro da cabine foi levantado para que pudéssemos ver o que estávamos fazendo. Uma vez que o digesto de pâncreas é despejado no béquer, os frascos são enxaguados com o mesmo tampão de lavagem e o tampão de lavagem é colocado sobre a peneira.Temos uma seringa cheia com tampão de lavagem. Utilizaremos isso para lavar com força o tecido através da peneira. A ideia é liberar quaisquer olhinhos soltos que não estejam presos à matriz, mas deixando as membranas e o tecido não digerido sobre a peneira.E quando você terminar de lavar um tecido, é isso o que geralmente se vê no final do procedimento. O tecido pancreático que está no fundo do tubo será agora transferido para dois cônicos de 50 ml, o tecido será lavado, misturado uniformemente e então distribuído de forma homogênea para que tenhamos um volume de pellet igual em cada tubo. O béquer é agora enxaguado com mais tampão de lavagem.As laterais são enxaguadas para recuperar todo o tecido que entrou no béquer novamente. Em seguida, o material é distribuído igualmente entre os dois tubos, ambos de 50 ml. Os tubos cónicos são então completados com tampão de lavagem.O tecido é invertido várias vezes e, em seguida, colocado em uma centrífuga. É uma centrifugação rápida. Permite-se que a centrífuga atinja mil RPM e, então, é desligada.O tecido neste momento é muito sensível; os olhinhos são muito delicados, e você não deve comprimi-los em excesso. Os tubos são removidos e realizaremos este passo de lavagem mais três vezes. Este é o fim da terceira lavagem.Os componentes do tubo cônico de 50 ml são transferidos para o tubo cônico de 15 ml e centrifugados a mil RPM, em seguida interrompidos. O sobrenadante será removido e a primeira parte do FI Call será iniciada. Estamos na etapa em que temos nosso digesto de pâncreas pelotado.Vamos ressuspender esse tecido para que fique bem solto em relação aos pellets. Vamos adicionar o primeiro gradiente de densidade, que é 1 1 0 8. Vamos adicionar cinco mililitros a cada tubo.O pellet é então misturado completamente em cada um dos gradientes. É importante que você obtenha uma boa distribuição do tecido no seu gradiente mais denso. Agora vamos sobrepor dois mililitros de densidade 1 0 9 6.Em seguida, adicionaremos por cima duas camadas de densidade 1 0 6 9 e, sobre essa, a densidade 1 0 3 7. É importante que, durante a sobreposição das densidades, você não as misture. Então, todas as camadas terão sido adicionadas ao tubo.E você pode ver que este é o topo de 1 1 0 8, o topo de 9 1 0 9 6, o topo de 1 0 6 9 e o topo de 1 0 3 7. E você pode observar que o tecido já está começando a migrar para sua densidade adequada, mesmo sem a centrifugação. Os gradientes de fial são levados à velocidade de 1800 RPM por 15 minutos, e lembre-se de manter o freio desligado após a remoção dos tubos da centrífuga.É possível observar entre a camada 0 0 9 6 e a camada 0 0 7 uma boa faixa de tecido de ilhotas de Pablo. Agora, removendo a camada 0 3 7 para eliminar qualquer detrito tecidual e DNA que possa ter sido liberado durante o processamento. Utilizando uma pipeta Pasteur plástica estéril, ele agora removerá a camada de ilhotas e as transferirá para um tubo cônico de 50 ml contendo 25 ml de tampão de lavagem.Você deseja fazer este passo rapidamente porque o fol é tóxico para os olhinhos. Na verdade, removemos toda a camada 0 6 9 e 0 9 6. Pavo corta a parte superior da pipeta de plástico e a enxágua com tampão de lavagem.Os orifícios são então centrifugados da mesma forma que centrifugamos anteriormente. A centrifugação é realizada a mil RPM, depois paramos e aspiramos. Os orifícios do sobrenadante serão lavados três vezes com meio de lavagem.Então, acabamos de concluir o processo de isolamento das pálpebras: partimos da digestão até o gradiente de fol, chegando aos clios purificados após a terceira lavagem com tampão de lavagem. Resuspendemos os clios no meio RPMI e os colocamos em uma placa de cultura de tecidos. Esses clios agora estão prontos para ensaios in vitro ou preparações in vivo, como o transplante de clios.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte I: a digestão e coleta de tecido pancreático), utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.

Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de ilhotas de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produzem hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. Este protocolo explica um método para isolar ilhotas pancreáticas pela primeira vez perfundindo colagenase via ampola de Vater para digerir o tecido pancreático exócrino e uma centrifugação simplificada com gradiente de densidade para purificar as ilhotas de camundongos.

Isolamento de ilhotas pancreáticas por meio de perfusão de colagenase: um método enzimático para isolar células de ilhotas pancreáticas

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar células de ilhotas pancreáticas do mouse para as induções ROS de triagem pelos xenobióticos para identificar os potenciais químicos xenobióticos de diabetogenic.

Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Aprenda o isolamento de ilhotas pancreáticas de camundongos C3H usando colagenase e gradiente de Ficoll. Este método viabiliza transplantes para modelos diabéticos NOD e avança pesquisas em endocrinologia.

Isolamento Islet murino de pâncreas

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