Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias
22 de abril de 2011
Neste relatório nós descrevemos um método para o isolamento e cultura do nicho de células progenitoras do rim do rato embrionárias que podem ser usadas para estudar vias de sinalização que regulam tronco / progenitoras células do rim em desenvolvimento. Estas células em cultura são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, que permite a manipulação eficiente das vias candidato.
O objetivo geral deste procedimento é gerar uma cultura primária de células da zona nefrogênica a partir do rim em desenvolvimento. Isso é realizado primeiramente dissecando rins de embriões do dia 17,5. O próximo passo do procedimento é remover as cápsulas renais.
Em seguida, realiza-se uma digestão enzimática limitada dos órgãos para destacar as células do mesênquima da cápsula e do estroma cortical da zona nefrogênica. O passo final do procedimento é o plaqueamento das células em fibronectina e o cultivo em meio livre de soro. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram uma população purificada de células da zona nefrogênica por meio de imunomarcação com marcadores específicos.
Embora este método possa ser usado para estudar sinalização celular, ele também pode ser aplicado para compreender os requisitos de substrato para expansão celular. Por exemplo, para técnicas de enxerto, o procedimento será demonstrado por Derek Adams, que é técnico no meu laboratório, e Aaron Brown, que é pós-doutorando no meu laboratório. Após preparar as soluções necessárias e tratar as placas de cultura celular de acordo com o protocolo escrito, inicie a dissecação de rim embrionário de camundongo sacrificando a mãe no dia E 17,5.
De acordo com as diretrizes institucionais, remova o útero e coloque-o em uma placa de Petri contendo vários mililitros de salina tamponada com docos sate ou DPVS com cálcio e magnésio. Sob um microscópio estereoscópico, use pinças de relojoeiro para remover cada embrião e outro par de pinças para decapitá-los. Após toda a ninhada ter sido removida do útero e decapitada, transfira os embriões para uma placa de Petri limpa contendo quantidade suficiente de DPBS com cálcio e magnésio para cobrir os embriões.
Deixe para trás o máximo possível de sangue e detritos teciduais em cada embrião; faça uma incisão circunferencial na parede abdominal ao nível dos umbilicais com uma pinça. Em seguida, posicione o embrião em decúbito dorsal e fixe os ombros com um par de pinças. Com um segundo par de pinças, remova os órgãos internos dos pulmões até a bexiga.
Os rins serão fixados na parte traseira do conjunto de órgãos internos. Em seguida, separe cuidadosamente os rins do restante dos órgãos. Tenha o cuidado de manter os rins conectados entre si.
Em seguida, segure o tecido entre os rins com um par de pinças e pegue a glândula adrenal aderida à cápsula de um dos rins com o outro par de pinças. Remova cuidadosamente a cápsula do rim. Tenha cuidado para não danificar o rim.
Certifique-se de remover qualquer cápsula remanescente do rim, bem como o útero, caso ainda esteja preso. Repita o procedimento com o rim restante. Por fim, corte uma pipeta de transferência em um diâmetro apropriado e transfira suavemente os rins para um tubo de poliestireno de cinco mililitros contendo HBSS.
Repita o isolamento dos rins para cada embrião e reúna os rins no tubo, até oito rins por tubo, em um ambiente estéril. Inicie o processo de digestão enzimática removendo primeiro a solução HBSS do tubo de cinco mililitros contendo os rins com uma pipeta. Tenha cuidado para evitar contato com os rins e adicione imediatamente 1,5 mililitro de colagenase, uma solução digestiva de Pancreatin.
Repita para cada tubo de rins e tampe os tubos. Em seguida, coloque-os em um agitador num incubador a 37 graus Celsius por 15 minutos. Pouco antes do término da incubação, adicione três microlitros de um microlitro por unidade de DNA a um tubo de poliestireno fresco de cinco mililitros para cada digestão que estiver sendo realizada.
Após a incubação, remova rapidamente o sobrenadante do incubador e adicione 75 microlitros de FBS invertendo o tubo três vezes para homogeneizar. Deixe em repouso à temperatura ambiente por dois minutos. Em seguida, transfira 1,4 mililitro da suspensão celular para um tubo de poliestireno de cinco mililitros contendo a Mistura de DNA e coloque em um agitador no incubador a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Após a incubação, transfira cada suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 325 × g durante cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante, centrifugue os tubos a 325 × g durante cinco minutos. Resuspenda o pellet em um mililitro de HBSS com 5% de FBS, pipetando para cima e para baixo de cinco a seis vezes.
Tampe cada tubo antes de passar para a próxima amostra. Após a centrifugação, remova o SNAT e adicione 500 microlitros de KSFM com aditivos a cada tubo depois que o meio tiver sido adicionado a todos os tubos. Resuspenda suavemente cada pellet celular pipetando para cima e para baixo cinco a seis vezes com uma micropipeta de um mililitro. Combine todas as suspensões celulares em um novo tubo de poliestireno de cinco mililitros.
Agora filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 mícrons previamente umedecido e colete o filtrado em um novo tubo de poliestireno. Evite tocar o filtro com a ponteira da pipeta assim que todo o filtrado tiver sido coletado. Refiltre o filtrado uma segunda vez através de um novo filtro de células previamente umedecido.
Remova o coador e tampe o tubo com um novo tubo estéril. Conte as células e plaque com uma densidade de 100.000 a 200.000 células por centímetro quadrado em KSM com aditivos em uma placa de cultura com fibra codificada. Deixe as células da zona nefrogênica recuperarem e aderirem em um incubador umidificado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas a quatro horas antes de qualquer estimulação para experimentação.
É mostrado aqui um contraste de fase. Imagem de 20 x de células da zona nefrogênica cultivadas a 200.000 células por centímetro quadrado e mantidas em cultura por 24 horas. Nesta imagem, as células da zona nefrogênica foram coradas com anticorpo anti-PAX2, específico para células progenitoras de néfrons e mostrado em vermelho, enquanto os núcleos em azul foram contra-colorados com DAPI.
Uma visão em contraste de fase de um agrupamento de progenitores de néfrons é mostrada com ampliação de 40 x. Para demonstrar ainda mais a especificidade, células da zona nefrogênica foram isoladas de embriões que possuem laxy sob o controle do promotor Fox D um, que é expresso na população de células estromais. Dentro da zona nefrogênica do rim em desenvolvimento, as células foram então coradas com DAPI Titan fi para núcleos em azul, foin para F actina em verde e anti beta lactase em vermelho.
Uma vez dominado, um cultivo primário em monocamada de células da zona nefrogênica pode ser gerado em aproximadamente duas horas. Esses cultivos facilitam estudos rápidos e de alto rendimento das vias de sinalização celular no desenvolvimento dos progenitores de néfrons, sendo altamente propícios ao tratamento com transdução viral, proteínas recombinantes e moléculas de baixo peso molecular. Além disso, procedimentos adicionais de separação celular podem ser utilizados para isolar tipos celulares específicos desses cultivos.
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Visão Geral
Este relato descreve um método para isolar e cultivar células progenitoras do rim de camundongo embrionário. As células cultivadas são adequadas para estudar vias de sinalização que regulam células-tronco/progenitoras no desenvolvimento renal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Nefrologia
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- A zona nefrogênica é crucial para o desenvolvimento renal.
- Compreender a sinalização de células progenitoras pode contribuir para a medicina regenerativa.
- Culturas primárias permitem a manipulação detalhada de vias celulares.
- A transdução viral aprimora a análise de vias.
Objetivo do Estudo
- Gerar uma cultura primária de células da zona nefrogênica.
- Estudar as vias de sinalização que regulam o desenvolvimento renal.
- Facilitar tratamentos com moléculas pequenas e proteínas.
Métodos Utilizados
- Dissecação de rins de embriões do dia 17,5.
- Remoção das cápsulas renais.
- Digestão enzimática para isolar tipos celulares específicos.
- Plaqueamento de células em fibronectina e cultivo em meio livre de soro.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de uma população purificada de células da zona nefrogênica.
- A imunomarcação confirmou a identidade das células cultivadas.
- As células são passíveis de transdução viral para manipulação de vias.
- Os resultados apoiam novos estudos sobre os sinais envolvidos no desenvolvimento renal.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para estudar células progenitoras renais.
- Abre caminhos para investigar alvos terapêuticos em doenças renais.
- Estudos futuros podem aproveitar este modelo para aplicações regenerativas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e cultivo de células da zona nefrogênica a partir do rim de camundongo embrionário permite a investigação direta da sinalização de células-tronco/progenitoras em um sistema controlado e acessível. Esta abordagem supera o desafio de estudar mecanismos de renovação versus diferenciação fora das limitações do cultivo de órgãos intactos, proporcionando confiança preditiva na validação precoce de alvos e na redução de riscos de vias. O método está estrategicamente posicionado para equipes de portfólio que buscam avançar programas de regeneração e modelagem de doenças com leituras celulares robustas e quantitativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a dissecção mecanicista de vias de sinalização que regulam a autorrenovação e diferenciação de progenitores de néfrons.
- Apóia a validação funcional de reguladores candidatos identificados por meio de triagens genéticas ou transcriptômicas.
- Facilita a desvinculação biológica de efeitos de proteínas específicas, moléculas pequenas ou silenciamento gênico.
- Oferece uma plataforma para previsão confiável na seleção de alvos em pipelines de doenças renais e medicina regenerativa.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece um sistema reprodutível de células primárias validado por marcadores para o desenvolvimento de ensaios quantitativos.
- Permite a avaliação padronizada dos efeitos de compostos sobre proliferação, morte celular e expressão de marcadores.
- Facilita a preparação para triagem de alto rendimento por meio da acessibilidade à transdução viral e ao tratamento com proteínas recombinantes.
- Permite o preparo escalonável de populações celulares relevantes para doenças, destinadas a fluxos de trabalho subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha descobertas in vitro com a biologia da zona nefrogênica in vivo para o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidade desde estudos mecanicistas em fase de descoberta até a validação em modelos pré-clínicos.
- Permite o avanço ajustado ao risco de hipóteses terapêuticas regenerativas e modificadoras da doença.
- Apoia a redução de riscos mecanicistas em portfólios de pesquisa de terapias celulares e doenças renais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de cultura celular primária conecta a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica, permitindo a manipulação direta e a análise quantitativa das decisões de destino celular das células progenitoras de néfrons.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a regulação de células-tronco/progenitoras e o mapeamento de vias.
- Triagem: Fornece um sistema validado e reprodutível para ensaios de compostos e perturbações genéticas.
- Análises: Gera dados quantitativos sobre proliferação, morte celular e expressão de marcadores para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Facilita a correlação entre achados in vitro e processos desenvolvimentais in vivo, bem como estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e adaptável para diversos programas de pesquisa renal e desenvolvimento terapêutico.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de desenvolvimento renal.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento e cultivo de células primárias para garantir reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e o progresso eficiente em termos de capital de projetos renais e regenerativos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e a transferência de conhecimento entre programas nas linhas de doenças renais e medicina regenerativa.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação embrionária, digestão enzimática e técnicas de cultivo celular primário.
- Exige acesso à infraestrutura de cultivo de tecidos, ferramentas de análise de marcadores e capacidade de transdução viral.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de isolamento celular, densidade de semeadura e validação de marcadores.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização das condições de digestão e cultivo.
- As limitações incluem a necessidade de temporização e manipulação precisas para preservar a viabilidade e o fenótipo das células progenitoras.
