Modificado ES / OP9 Co-Protocol Cultura Fornece Caracterização melhorada de Progênie Hematopoiéticas

O objetivo geral do experimento a seguir é diferenciar células-tronco embrionárias murinas em várias linhagens hematopoiéticas primitivas e definitivas. E para caracterizar todos os descendentes das ES, a diferenciação celular hematopoiética murina é obtida colocando as células ES sobre uma camada estromal OP9 M de morango fluorescentemente marcada e confluente. Cada dia de diferenciação ou co-cultivo representa os diversos estágios do desenvolvimento hematopoiético no momento apropriado de colheita.

A prole de células ES diferenciadas pode ser separada da linhagem celular estromal M strawberry OP nine por meio de separação celular. Este protocolo de diferenciação de ES recapitula a hematopoiese primitiva e definitiva conforme observado in vivo e pode ser utilizado para caracterizar defeitos hematopoiéticos associados a linhagens celulares ES com genes knockout sem o uso de embriões. Olá, bem-vindo ao laboratório da Dra. Judith Gassen no Centro Oncológico Integral Johnson da UCLA.

Meu nome é Alicia Poz. A principal vantagem da técnica que vou mostrar a você hoje em relação aos métodos de co-cultivo ESO nove existentes é que este procedimento permite a passagem de todas as células do dia cinco e do dia oito, bem como a separação completa de toda a progênie derivada de ES. As células estromais OP9 M de morango são cultivadas em meio de cultura celular OP9, que deve ser trocado a cada dois dias.

As células OP nine devem ser subcultivadas três dias antes de serem necessárias para o cultivo em co-cultura. É importante observar que, durante a manutenção, as células OP nine nunca devem ser mantidas em densidade superior a 90% de confluência. Primeiro, lave as células duas vezes com PBS, em seguida adicione tripsina EDTA 0,1% PRÉ-AQUECIDA por cinco minutos, até que as células se desprendam. ADICIONE o meio de cultura das células OP nine e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros.

Centrifugue as células em tubo a 300 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em meio de cultura fresco M strawberry OP9. Plaque as células com densidade mínima de 10⁴ células/cm² no dia em que o experimento de co-cultura for iniciado. As células OP9 subcultivadas há três dias devem estar confluentes. As células ES devem ser cultivadas de acordo com o protocolo padrão para a linhagem celular específica utilizada.

Lave as células ES duas vezes com PBS contendo tripsina a 0,25% e EDTA, e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione o meio de diferenciação em co-cultura às células ES e transfira-as para tubos cónicos de 15 mililitros. Pelotize as células ES a 400 ×g por cinco a sete minutos à temperatura ambiente.

Após remover o sobrenadante, ressuspenda as células ES em meio de diferenciação para co-cultivo. Utilize uma agulha de ponta romba de 21 gauge para obter uma suspensão de células simples. Conte as células utilizando azul de tripano e um hemocitômetro.

Agora, retire o frasco de M strawberry. OP nove células do incubador. Remova o meio das OP nove células e adicione meio de diferenciação em co-cultura ao frasco-placa.

Um vezes 10 elevado à terceira células ES por centímetro quadrado para cada frasco de células M strawberry OP nine; incubar as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono com umidade. Este é o dia zero e o co-cultivo deve apresentar esta aparência. Três dias após o início do co-cultivo de células ES M strawberry OP nine.

Observam-se principalmente grandes aglomerados planos de progênie derivada de ES com bordas definidas, e alguns redemoinhos de células terão começado a se formar. Remova cuidadosamente o meio da co-cultura e substitua por meio de diferenciação fresco cinco dias após o início da co-cultura. A diferenciação adequada de células ES sobre uma camada confluente de células OP9 M strawberry deve resultar em hemanoblastos, que aparecem como aglomerados sobrepostos de células.

O aspecto mais crítico deste procedimento é garantir uma diferenciação adequada no quinto dia de co-cultura. Neste ponto, é possível observar as colônias de hemanoblastos não apenas microscopicamente, mas também macroscopicamente. Lave cuidadosamente a co-cultura duas vezes com PBS e desanexe as células do gelo com tripsina 0,25% EDTA, removendo as células do frasco com meio de diferenciação ES e transferindo-as para um tubo. Centrifugue as células a 400 G durante sete minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação, remova o sobrenatante e adicione meio novo. Em seguida, utilize uma agulha romba de calibre 21 para ressuspender as células e garantir uma suspensão de células isoladas. Conte as células utilizando um hemocitômetro; deve haver um aumento de 100 a 150 vezes no número de células ES em relação ao dia zero. Replante as células em co-cultura sobre uma nova camada de células OP9 confluentes no oitavo ou nono dia e novamente no dia 12, conte as células novamente. Remova o meio contendo as células hematopoiéticas e reserve.

Lave a monocamada uma vez com PBS para remover as células hematopoéticas em suspensão e reserve. Adicione tripsina 0,25% EDTA ao frasco após a aderência das células, desprenda as células do frasco com meio de diferenciação ES e adicione às células hematopoéticas encontradas em suspensão. Centrifugue as células a 400 ×g durante sete minutos à temperatura ambiente. Por fim, re-suspenda as células usando uma agulha de ponta romba de 21 gauge e conte as células. As células estão agora prontas para serem replatadas ou utilizadas em ensaios subsequentes.

O sistema de co-cultivo ES M morango OP nove pode ser usado para modelar o desenvolvimento hematopoiético descrito. Abaixo há uma visão geral dos dias do curso temporal de co-cultivo em que os progênitos ES diferenciados precisam ser transferidos para novas células M morango OP nove. A diferenciação adequada de células ES sobre uma camada confluente de células M morango OP nove resultará na produção de flick um positivo.

No quinto dia da cocultura, os angioblastos humanos — que são os precursores mesodérmicos comuns para as linhagens endotelial e hematopoiética — devem aparecer como aglomerados compactos de células, conforme mostrado nesta imagem. Conforme a cocultura progride, agrupamentos de duas a quatro células devem surgir no sexto ou sétimo dia e crescer formando aglomerados celulares maiores. No oitavo ou nono dia, já estão presentes precursores hematopoiéticos, enquanto as linhagens hematopoiéticas diferenciadas terminais aparecem no dia 14.

Em contraste, um co-cultivo com diferenciação inadequada de ESL resultará em progênie derivada de ES que não apresenta um padrão em forma de mundo no quinto dia. A ausência de células em um padrão em forma de mundo indica formação inadequada de blastos GIO. Um co-cultivo com formação inadequada de eblastos acabará resultando em diferenciação estagnada da linhagem hematopoética e deve ser descartado com este protocolo modificado de co-cultivo ES OP nove.

A progênie derivada de ES é negativa para strawberry e pode ser separada por citometria de fluxo de M positivo para strawberry. OP nove células em qualquer dia de co-cultivo para avaliação. Os resultados de um experimento representativo são mostrados aqui.

Protocolos de co-cultivo ES OP nove publicados anteriormente focaram-se exclusivamente na passagem e avaliação das células flutuantes não aderentes. Neste protocolo modificado, todas as células derivadas de ES, tanto as aderentes quanto as não aderentes, são passadas e podem ser avaliadas. Isso resulta em maiores rendimentos de células hematopoiéticas, permite a identificação de populações raras de células e possibilita a caracterização completa de toda a prole de ES, tanto hematopoiética quanto não hematopoiética.