Name: Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Aprenda a dissecção do olho de rato para obter montagem inteira do epitélio pigmentar da retina. Esta técnica é essencial para estudar desenvolvimento retiniano e doenças oculares em pesquisas de neurociência.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental [K22ES012264 para AJRB] e um American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloto projectaward [para AJRB]. Agradecemos também aos membros do laboratório de Bishop para a leitura crítica do manuscrito e comentários sobre o vídeo e Adam Brown, em particular, para a exemplo do que não fazer. Agradecemos ao Dr. Donald McEwen de Câncer Greehey infantil Research Institute por nos permitir o uso de seu escopo dissecar / vídeo câmera set-up para as filmagens do vídeo de dissecação. Agradecemos a Daron Brown em Instrumentos Corte para afiar e reparação de nossas ferramentas de microdissecção.

1. Remover o tecido Extraneous do lado de fora do olho <ol><li> Despeje 1X PBS na tampa de um prato de 35 mm. O nível deve ser logo abaixo da borda da tampa. </li><li> Utilizando uma pinça reta, olhos de transferência (s) do tubo de armazenamento para o prato de 35 mm. Olhos estão submersos em PBS, por duas razões: 1. Os tecidos estranhos irá "flutuar" longe dos olhos para que você possa ver e removê-los facilmente, e 2. Durante a dissecção, o olho vai, naturalmente, manter a sua forma esférica, enquanto em suspensão, permitindo que você trabalhe com este formato e não contra ela. </li><li> Utilizando ambas as pinças anguladas (45 ° e 15 °), remova tanto músculo e tecido conjuntivo possível, puxando o tecido contra a corrente (ou seja, em direção à córnea). Alguns tecido conjuntivo permanecerá. Esforço deve ser feito para comprimir o globo ocular o mínimo possível. </li><li> Comércio seus 15 ° para pinças tesouras primavera. Enquanto mantém o olho fixo com 45 pinças °, use a tesoura para cortar mola muscular restantes e do tecido conjuntivo, bem como o nervo óptico. * Dica: Use a borda externa da tesoura para empurrar o tecido de encontro à grão (em direção a divisão córneo-escleral) e depois cortar. Continue até que todo o tecido estranho foi removido do olho. </li></ol> 2. Remova a córnea ea lente <ol><li> Com a córnea para cima, use a pinça de 45 ° a beliscar-se uma pequena dobra no centro da córnea. </li><li> Usando a tesoura primavera, fazer uma pequena incisão na base do retalho. Deixar de ir a retalho. </li><li> Mantendo os olhos ainda com o fórceps, inserir o menor lâmina de tesoura para dentro e perpendiculares à incisão e fazer um corte para a divisão córneo-escleral. Tente manter a sua menor lâmina sob a íris para tanto a córnea ea íris são cortadas. Não corte todo o caminho para a divisão córneo-escleral. Mantenha tesouras inserido no olho. </li><li> Usando o seu fórceps de 45 °, cuidadosamente girar o olho para que sua tesoura são paralelos ao dividir córneo-escleral e fazer um pequeno corte. Girar lentamente os olhos de 360 ​​°, fazendo pequenas incisões em toda a volta. Mais uma vez, tentar manter a parte inferior da lâmina da tesoura sua primavera sob a íris para que ambos íris e córnea são cortados. Levante a íris ea córnea longe do resto do olho e descartá-las. </li><li> Incline o olho do seu lado e pressione suavemente na metade posterior do olho, forçando a lente para fora. Descarte da lente. O interior da ocular restante está alinhada pela retina neural, que deve ser suave e opaca. </li></ol> 3. Trimestre a ocular, resultando, resultando em um 4 - "pétalas", flor-como a estrutura <ol><li> O olho deve estar posicionado de tal forma que a abertura da ocular é perpendicular ao seu corpo. Use sua pinça de 45 ° a posição firme e ocular o. </li><li> Segurando uma tesoura sua primavera na frente de você assim que são perpendiculares ao seu corpo, insira a parte inferior da lâmina da tesoura sua primavera na borda superior do copo olho aberto. Usando o seu fórceps de 45 °, alinhe cuidadosamente o copo olho para que um corte, única reta pode ser feita a partir da divisão córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico. Todos os cortes devem ser perpendicular à divisão córneo-escleral ea menos que especificado, deve ir tão perto da cabeça do nervo óptico quanto possível, sem cortá-lo. </li><li> Gire a ocular 180 °, mantendo a sua perpendicularidade com o seu corpo. Usar a técnica em passo 3.2 para fazer um corte perpendicular segundo. </li><li> Gire a ocular e repita a técnica descrita em 3.2 para fazer dois cortes mais. Todos os quatro cortes devem ser tão próximas a 90 ° entre si quanto possível. Tenha em mente que o olho não é perfeitamente esférica para que haja alguma variabilidade. </li></ol> 4. Corte cada um dos quatro "pétalas" no meio, resultando em uma estrutura de oito pétalas de flores como <ol><li> Transferência a ocular esquartejado do prato 35 milímetros para uma lâmina limpa. Com a ocular para cima, colher por baixo com as 45 forceps °. Cuidadosamente retire-o do líquido e colocá-lo em uma lâmina limpa. </li><li> Utilizando ambas as pinças anguladas, gentilmente abrir o olho, com a retina neural voltada para cima. NÃO REMOVA A NEURAL RETINA-ajuda o olho manter alguns de seus forma esférica para que você não está trabalhando contra ela. Também protege o RPE de ser acidentalmente danificados nos procedimentos a seguir. </li><li> Gire o slide até que uma das pétalas é perpendicular ao seu corpo. </li><li> Use seus 15 forceps °, agarram delicadamente o canto da pétala. O canto da pétala deve ser córnea, retina neural ou não RPE. Levante o canto suave, permitindo-lhe manter a sua curvatura. </li><li> Insira a lâmina inferior da tesoura sua mola entre a pétala eo slide. Line up suas tesouras de tal forma que uma única linha reta, corte perpendicular pode ser feita a partir da divisão córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico. Corte o mais próximo da cabeça do nervo óptico como withou possívelt cortá-lo. Deixar de ir a pétala, permitindo que ele deitar no slide. </li><li> Girar a lâmina de 90 °, de modo que a pétala seguinte é perpendicular ao seu corpo. Repita o passo 4.5. </li><li> Repita os passos 4.5 e 4.6 mais duas vezes. A estrutura resultante deve ser semelhante a uma flor de oito pétalas. </li></ol> 5. Remova a retina neural <ol><li> Pipeta 100-200 mL de 1X PBS para a amostra. Isso impedirá que a retina neural grude que você retire-a do EPR. </li><li> Tipicamente, a retina neural é vagamente ligado ao RPE. No entanto, ele requer prática e habilidade para remover somente a retina neural e não o RPE. Gentilmente segure uma pétala da retina neural com um par de pinças anguladas estabilizando ao mesmo tempo (mantendo) o resto do olho com o outro par de pinças anguladas. Puxe a retina neural longe do resto do olho. Continue este procedimento até a retina inteiras neural foi removido. * Dica: furar a ponta do seu 15 ° para forceps cabeça do nervo óptico para ancorar o olho. Em seguida, use a pinça de 45 ° para varrer debaixo da retina neural e retire-a e longe. Geralmente é melhor para levantar a retina neural da cabeça do nervo óptico em direção ao dividir córneo-escleral. Certifique-se de afastar quaisquer vestígios da íris frouxa. A íris é muito pegajosa e pode ficar preso de outra forma para o EPR. </li><li> Lavar a amostra com PBS 1X. Pipeta 100-200 mL de 1X PBS para a amostra e chupar-lo de volta. Descartar a PBS. Repita conforme necessário para remover a poeira e detritos. </li></ol> 6. Monte você espécime (s) em um slide <ol><li> Pipeta 80-90 mL de glicerol 90% para um novo slide em uma forma retangular. Use o lado da ponta da pipeta para fazer um esfregaço, mesmo retangular de glicerol. (Este é o procedimento para a montagem de dois RPE em um slide.) </li><li> Insira o antebraço de 15 de fórceps ° sob o espécime. Levante cuidadosamente a amostra para fora do diapositivo de dissecação. </li><li> Abaixe lentamente a amostra para o glicerol. Abanando as pinças como você retirá-los de debaixo do espécime. </li><li> Repita os passos de 6,1-6,3 para o outro espécime. </li><li> Gire o slide para que o lado mais longo é perpendicular ao seu corpo. Segure o vidro da tampa em um ângulo de 45 ° para o slide de forma que ele está tocando o slide. Movê-lo para o esfregaço glicerol até que eles toquem. Manter contato entre a tampa de vidro e deslize, mova lentamente a tampa de vidro longe da mancha, em direção à borda do slide. Alinhe os lados da lâmina ea tampa de vidro de modo que eles são paralelos. Segure os cantos da tampa de vidro entre o polegar eo indicador. </li><li> Pegar o 15 ° em uma pinça a outra mão. Berço da borda (grátis) superior da tampa de vidro na dobra do braço. Muito lentamente, abaixe a tampa de vidro. Quando o contato é feito entre o vidro da tampa e do glicerol, pare e espere que o glicerol para migrar. Repita esse rebaixamento e espera até que as montagens RPE todo são totalmente cobertos. Isso é para evitar o glicerol altamente viscoso de capturar as bolhas de ar. NÃO empurre para baixo a lamela - o glicerol vai apertar debaixo dela, fazendo de adesão muito pobre. </li><li> Com claras unha polonês, pintura em torno do perímetro onde a tampa de vidro e deslize se encontram. </li><li> Coloque o slide em cima de uma prateleira vazia para secar. </li></ol> 7. Resultados representativos: O resultado deste procedimento deve ser uma estrutura que se parece com uma flor e deve ser bastante simétricos. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. RPE montar todo a partir de um rato C67Bl/6J tipo selvagem. RPE de preto ou animais cutia deve ser de cor marrom escuro e deve ter uma superfície lisa. É normal a notar ondulações na topografia das pétalas. A pigmentação em qualquer espécime dar pode ser um pouco variável, devido à densidade variável de pigmentação de ambos RPE ea coróide subjacente. Setas brancas apontam para hipopigmentadas "canais" - isto é normal e é devido à vascularização subjacente do olho. Azul seta aponta para danos físicos aos dois RPE ea coróide subjacente. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. RPE montar todo a partir de um camundongo diluído. Amostras colhidas de animais diluir pode variar de cor de quase transparente para café au lait e qualquer um espécime é como ter variabilidade dentro dela, indicado em círculos negros aqui. Em geral, RPE colhidas de animais mais jovens são mais leves e aqueles colhidos de animais mais velhos são mais escuras. Setas pretas indicam alguns dos vasculatura subjacente, que aparece hipopigmentadas. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Faloidina coloração pode ser usado para detectar danos físicos ao RPE. Coloração faloidina define claramente as membranas celulares, mostrando a forma hexagonal do epitélio. (A) Exemplo de um rato preto. (B) Exemplo de um camundongo diluído. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. A RPE mal dissecados de um camundongo diluído. (A) Os colchetes indicam margens de córnea que são demasiado grandes, que podem causar deformação e / ou dobrar. Dentro do círculo preto você pode ver uma quantidade excessiva de tecido estranho que não tenham sido removidos da parte traseira do olho. Eles são particularmente evidente, porque a amostra é de um animal diluída. A pétala no canto inferior esquerdo é parcialmente dobrada. (B) Esta montagem tem toda a aparência de um cata-vento. Setas pretas indicam alguns dos cortes que foram feitos. Muitos dos cortes, desde desigualdade córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico não estão em conformidade com o diâmetro. (C) setas pretas indicam como os cortes deveriam ter sido feitas, de acordo com o diâmetro ea perpendicular à tangente.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O RPE é o site da p un ensaio, um ensaio in vivo de homologia dirigido reparação. O ensaio p un tem sido usado para estudar os efeitos dos danos de DNA diferentes 1,2 e sinalização de danos ao DNA e genes de reparo 3,4,5 sobre a freqüência de homologia dirigido reparação. Este ensaio é altamente sensível, detectando uma única célula eventos no RPE 1. Ele também pode detectar diferenças no momento de homologia-dirigido eventos de r...

<table><tbody><tr><td>pinça reta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>ponta: 0,08 x 0,04 mm material: INOX</td></tr><tr><td>pinça de 45&amp;#x00B0;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>ponta: 0,05 x 0,01 mm material: INOX</td></tr><tr><td>pinça &quot;para cima&quot; de 15&amp;#x00B0;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>ponta: 0,1 x 0,06 mm material: INOX</td></tr><tr><td>tesoura com mola</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>largura da ponta combinada 0,3 mm, comprimento da borda cortante 3 mm, material: aço inoxidável</td></tr><tr><td>microscópio estereoscópico binocular</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>usar fonte de luz refletida</td></tr><tr><td>faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Do epitélio pigmentar da retina (EPR) está no fundo do olho dos mamíferos, logo abaixo da retina neural, que contém os fotorreceptores (cones e bastonetes). O EPR é uma monocamada de células pigmentadas cuboidal e associados estreitamente com a retina neural logo acima dele. Esta associação faz com que o RPE de grande interesse para pesquisadores que estudam doenças da retina. O RPE é também o local de um ensaio in vivo de homologia dirigido reparo do DNA, o ensaio p un. O olho do rato é particularmente difícil de dissecar, devido ao seu pequeno tamanho (cerca de 3,5 milímetro de diâmetro) e sua forma esférica. Este artigo demonstra detalhadamente um procedimento para dissecação do olho, resultando em uma montagem de todo o RPE. Neste procedimento, vamos mostrar como trabalhar com, e não contra, a estrutura esférica do olho. Resumidamente, o tecido conjuntivo, músculo e do nervo óptico são removidos da parte traseira do olho. Então, a córnea eo cristalino são removidos. Em seguida, os cortes são feitos estratégicas que resultam em achatamento significativo do tecido remanescente. Finalmente, a retina neural é suavemente levantado, revelando um RPE intactas, o que ainda está ligado à coróide subjacente e esclera. Esta montagem inteira pode ser usado para executar o ensaio p un ou para avaliação imuno-histoquímica ou imunofluorescência do tecido EPR.

Uma demonstração formal da dissecação de um olho de rato, resultando em uma montagem de todo o epitélio pigmentar da retina.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

O epitélio pigmentar da retina (EPR) localiza-se na parte posterior do olho de mamíferos, logo abaixo da retina neural, que contém os fotorreceptores (bastonetes e ...

Meu nome é Allison Clavon. Sou assistente de pesquisa da Dra. Alex Bishop no Instituto de Pesquisa sobre Câncer Infantil Gree, no Centro de Ciências da Saúde da UT, em San Antonio, Texas. Hoje vou demonstrar como dissecar um olho de roedor para obter uma amostra inteira do epitélio pigmentado da retina.Esse tecido é de interesse para o estudo do desenvolvimento e das doenças da retina e também é o local de um ensaio de reparo do DNA direcionado por homologia in vivo. Então vamos começar. Aqui está um olho pronto para a dissecação.Primeiro, vamos analisar as estruturas anatômicas que você usará como pontos de referência durante todo o procedimento. Estes são os olhos de um animal diluído. Aqui está o nervo óptico na parte traseira do olho oposto.Essa é a córnea. A íris é visível através da córnea. A área esbranquiçada na parte posterior do olho é a esclera.Portanto, essa região é chamada de divisão córneo-escleral. O primeiro passo da dissecação é remover tecidos estranhos, como tecido conjuntivo muscular e o nervo óptico. Em seguida, a córnea deve ser removida, fazendo um corte circular.Neste ponto, a lente pode ser removida, resultando em uma cúpula ocular oca. Em seguida, quatro cortes são feitos a partir da divisão córneo-escleral em direção ao disco do nervo óptico. A estrutura resultante assemelha-se a uma flor com quatro pétalas.Cada uma dessas quatro pétalas é então cortada ao meio, resultando em uma estrutura que se assemelha a uma flor de oito pétalas. Nesta etapa, o I pode apresentar ondulações em algumas áreas devido à sua natureza esférica. Para combater isso e obter uma montagem de orifício mais plana, você pode fazer oito cortes mais curtos logo após a ondulação.Você precisará ter vários materiais prontos em sua estação de trabalho, incluindo uma pipeta de 100 ou 200 p e respectivas ponteiras, lâminas com lamínulas X-P-B-S-A de 35 milímetros, glicerol a 90% e esmalte incolor para o preparo das lâminas, um suporte para secar as lâminas, uma caixa de lenços Kim e um recipiente de descarte de resíduos. Além desses materiais comuns, você também precisará de um conjunto de ferramentas especializadas para microdissecação, incluindo pinças retas e pinças anguladas em 45 graus, usadas para segurar, girar e manipular geralmente o olho durante toda a dissecação. Essas pinças de 15 graus têm um ângulo ascendente e também são utilizadas para manusear e manipular o olho.Por fim, você precisará de um par de tesouras de mola. É muito importante que você use tesouras de mola em vez de tesouras do estilo tradicional. Para esta dissecação, antes de começar a dissecação, certifique-se de que a altura da sua cadeira esteja ajustada de modo que, quando você estiver sentado ereto, seus olhos fiquem no mesmo nível dos oculares.Curvar-se sobre o microscópio causa dor nos ombros e nas costas e prejudica a qualidade de suas dissecações. Para começar, despeje um XPBS na tampa da placa de 35 milímetros. Em seguida, transfira os olhos que você pretende dissecar para a placa.Este é um olho de um camundongo selvagem tipo C57 preto. Você pode observá-lo como sendo muito pequeno, com cerca de três milímetros e meio de diâmetro. A opacidade da esclera confere a ele uma tonalidade azulada.O primeiro passo na dissecação é remover todos os tecidos extranhos ao redor do olho, como o tecido conjuntivo muscular e o nervo óptico. Aqui, tenho a pinça de 45 graus na mão esquerda e a pinça de 15 graus na mão direita. Você pode usar um par de pinças para imobilizar o olho enquanto puxa o tecido com a outra.Quando um pedaço grande de tecido se soltar, limpe cuidadosamente sua pinça em um lenço Kim. Apenas tenha cuidado para não esmagar ou perfurar o olho. Um dos benefícios de realizar essa dissecação em suspensão é que é possível visualizar facilmente o tecido conjuntivo se afastando do olho.Eventualmente, você atingirá um ponto em que não poderá remover mais tecido usando pinças. Substitua suas pinças com ângulo de 15 graus por tesouras de mola. Use as tesouras de mola para cortar o nervo óptico.Use a borda externa da lâmina para empurrar o tecido para frente, em direção à junção córnea-escleral. Em seguida, corte e limpe suavemente as tesouras em um lenço de papel. Vamos observar isso novamente.Empurre o tecido para frente, em direção à junção córneo-escleral, com a borda externa da sua tesoura quando o tecido estiver saliente. Corte, continue empurrando pedaços de tecido para frente com a borda romba da tesoura e depois remova-os até que todo tecido extranumerário seja eliminado. Geralmente há duas faixas de tecido resistente no olho.O primeiro está fixado na junção esclerocorneana, e o segundo está sendo mostrado durante o corte. Aqui está aproximadamente na metade do caminho entre a junção esclerocorneana e o disco do nervo óptico. O próximo passo na dissecação é remover a córnea e o cristalino.Use sua pin&ccedil;a de 45 graus para levantar uma aba aproximadamente no meio da c&oacute;rnea. Em seguida, use sua tesoura de mola para fazer uma pequena incis&atilde;o na base da aba. Insira a l&acirc;mina inferior da tesoura na incis&atilde;o, sob a &iacute;ris.Realize um corte em direção, mas não dentro, da divisão córneo-escleral. Agora, gire lentamente o olho 360 graus, fazendo pequenos cortes ao redor. Tente manter a tesoura sob a íris, cortando ao mesmo tempo a córnea e a íris.É preciso muita prática para fazer isso com tanta facilidade quanto mostro aqui. Uma vez removida a córnea, vire o olho de lado e pressione suavemente a parte externa do olho, expulsando a lente. A estrutura restante terá, a seguir, forma semelhante a um copo.O olho deve ser dividido em quartos. Para fazer isso, vire o olho de lado e insira a lâmina inferior da sua tesoura de mola. Faça um corte longitudinal em direção ao disco do nervo óptico, mas sem atingi-lo completamente.Para fazer isso, mantenha os braços ao lado do corpo e as tesouras à sua frente, aproximadamente perpendiculares ao seu corpo e ao corte no olho. Faça o segundo corte diretamente oposto ao primeiro corte. Tome seu tempo para alinhar corretamente, de modo que possa realizar um corte suave.Realizar múltiplos cortes pode causar irregularidades, mas se alinhados cuidadosamente, não são perceptíveis; observe como consigo trabalhar com essa forma esférica do olho, em vez de contra ela, porque o olho mantém sua forma normal. Quando suspenso em PBS, o restante da dissecação será realizado em uma lâmina. Segure o olho com sua pinça em ângulo de 45 graus e levante-o para fora do PBS.Coloque o olho em uma lâmina nova. Usando os dois pares de pinças anguladas, desdobre cuidadosamente o olho. Observe que há uma pequena margem de córnea e íris ao redor da periferia do olho, o que é útil para manipulação.Em seguida, você precisa cortar cada um dos quatro pedais ao meio. Gire o olho de modo que um dos pedais fique perpendicular ao seu corpo. Segure o canto do pedal com a pinça em um ângulo de 15 graus.Levante levemente e, em seguida, faça um corte a partir da junção córneo-escleral em direção ao disco do nervo óptico. Esses cortes devem ser perpendiculares a uma tangente. Uma tangente é uma linha que é perpendicular ao diâmetro.Portanto, seus cortes devem estar alinhados com o diâmetro do olho. Agora, gire a lâmina para que o próximo pétalo fique perpendicular ao seu corpo e repita. Segure a extremidade do pétalo.Levante levemente e corte. Repita até que cada um dos quatro grandes pedículos tenha sido cortado ao meio. A substância esbranquiçada é a retina neural, que recobre diretamente o EPR.A retina neural pode proteger o EPR, portanto deixe-a intacta até que todos os seus cortes tenham sido feitos. Observe como as pétalas são ligeiramente curvas. Não resista a isso.Tenha calma para alinhar corretamente e poder fazer um único corte preciso. Como o olho é redondo, tem tendência a dobrar; para evitar esse encurvamento, você pode fazer oito cortes rápidos.Um em cada pétala. Utilize a mesma estratégia básica da rodada anterior de quatro cortes. Levante o canto do pétala e corte, mas neste caso, corte apenas cerca da metade do comprimento do pétala.Depois de fazer todos os cortes, você pode remover a retina neural. Aqui estou adicionando algumas gotas de PBS 1X ao espécime. Você não deve deixar seu epitélio pigmentado da retina secar.A retina neural deve estar apenas fracamente associada ao epitélio pigmentado da retina subjacente. É possível observar que ela se solta com bastante facilidade. No entanto, geralmente permanecerá aderida na divisão córneo-escleral, que, na parte interna do olho, é uma crista irregular chamada corpo ciliar.Você pode inserir a ponta de sua pinça de 15 graus no disco do nervo óptico para fixar o espécime enquanto remove a retina neural. O corpo ciliar marca a borda do epitélio pigmentado da retina (RPE), o tecido fortemente pigmentado que foi removido. Aqui está a íris, não o RPE.Recomendo remover o máximo possível da íris, pois ela é muito aderente e pode dobrar e grudar no epitélio pigmentado da retina (RPE) se a retina neural estiver esfoliando ou se restos dela permanecerem aderidos ao RPE. Provavelmente ocorreu um de dois problemas: ou os olhos não foram fixados corretamente, por tempo excessivo ou insuficiente, ou permaneceram em armazenamento por muito tempo antes da dissecação.O pedal que estou revelando aqui ainda não possui seu atalho. É possível observar como o pedal está a cerca de um terço do caminho a partir da borda da RPE. Por isso são recomendados os oito atalhos.Após descartar toda a Retina neural, use uma pipeta para lavar o epitélio pigmentado da retina (RPE) várias vezes com 100 a 200 microlitros de PBS até que toda a poeira e detritos tenham sido removidos. Pipete 80 a 90 microlitros de glicerol a 90% sobre uma lâmina limpa, em formato retangular. Observe que este é o volume ideal de glicerol para um lamínula de 22 por 50 milímetros e deve ser ajustado conforme necessário.Para outros tamanhos de lamínula, use a ponta da pipeta para espalhar o glicerol. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no glicerol. Caso apareça uma bolha, arraste-a até a borda, onde ela irá estourar.Deslize o braço inferior da pinça de 15 graus sob o EPR e levante com cuidado, abaixando lentamente o EPR no glicerol. O EPR flutuará na superfície do glicerol e poderá enrolar ou torcer um pouco. Use a pinça para alinhar o EPR e para arrastar o glicerol sobre a superfície do EPR.Se bolhas de ar se formarem, enquanto faz isso, mova-as até a borda, onde estourarão, segurando o lamínula em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Toque-a na borda do glicerol.Em seguida, mova-o em direção à borda da lâmina. Segure a parte inferior do lamínula com o polegar e o indicador e apoie a borda oposta com a pinça de 15 graus. Abaixe lentamente o lamínula em direção à lâmina assim que o contato for estabelecido.Com o EPR, pare de abaixar, permitindo que o glicerol migre enquanto você continua a abaixar lentamente a lamínula. Se você abaixar a lamínula muito rapidamente, bolhas de ar serão incorporadas à sua lâmina neste ponto. Vou abaixar lentamente a lamínula ao tocar o EPR e permitir que o glicerol migre.Você pode observar que, quando solto rapidamente o lamínula, bolhas de ar são incorporadas. Use uma quantidade generosa de esmalte incolor para fixar a borda do lamínula ao lâmina, contornando completamente todo o perímetro.Este é um epitélio pigmentado da retina (EPR) típico de um camundongo preto C57. É normal observar a vasculatura subjacente, conforme indicado aqui. Também é normal observar alguma variação na pigmentação, como manchas que parecem menos pigmentadas.No entanto, manchas claras como esta provavelmente são decorrentes de danos físicos ao epitélio pigmentado da retina (RPE) e à coroide subjacente. Como a coroide do olho também é pigmentada, é possível que danos em um RPE escuro passem despercebidos se a coroide permanecer intacta.Este é um RPE típico de um camundongo diluído. Como indicado, você será capaz de visualizar a vasculatura e haverá alguma variação na pigmentação, como manchas mais escuras e manchas mais claras. No entanto, é quase impossível observar danos em um RPE diluído.Essas pequenas manchas são danos ou variações normais na pigmentação? Sugerimos fixação e coloração para responder a essa pergunta. Isso dará uma ideia se você está manipulando o tecido com muita aspereza.A coloração delinea claramente as membranas celulares, tornando evidentes os pontos danificados, mas, na realidade, o epitélio pigmentado da retina (RPE) é bastante resistente, e se você manipular o olho pela córnea, é improvável que cause danos. Aqui há uma preparação em montagem inteira com uma série de problemas, sendo o menor deles indicado aqui como uma margem excessivamente ampla de córnea, o que pode levar ao enrugamento e dobramento do material ondulado. Pode-se observar aqui um tecido extranumerário maciço ainda presente na parte posterior do olho.Este pedal está parcialmente dobrado, e aqui você pode ver que o EPR foi parcialmente rasgado. Outro problema é que este olho tem a aparência de uma cata-vento. Aqui desenhei os ângulos dos cortes.No entanto, é assim que eles deveriam estar. Lembre-se, seus cortes devem ser perpendiculares à tangente e alinhados com o diâmetro. Acabei de demonstrar como dissecar um olho de camundongo para um preparo inteiro do epitélio pigmentar da retina.Epitélio, a coisa mais importante é manter uma boa postura, mas tente permanecer relaxado. Espero que você tenha achado este vídeo útil e desejo a você todo o sucesso em seus futuros experimentos.

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Research

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Neuroscience

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