Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

Meu nome é Allison Clavon. Sou assistente de pesquisa da Dra. Alex Bishop no Instituto de Pesquisa sobre Câncer Infantil Gree, no Centro de Ciências da Saúde da UT, em San Antonio, Texas. Hoje vou demonstrar como dissecar um olho de roedor para obter uma amostra inteira do epitélio pigmentado da retina.

Esse tecido é de interesse para o estudo do desenvolvimento e das doenças da retina e também é o local de um ensaio de reparo do DNA direcionado por homologia in vivo. Então vamos começar. Aqui está um olho pronto para a dissecação.

Primeiro, vamos analisar as estruturas anatômicas que você usará como pontos de referência durante todo o procedimento. Estes são os olhos de um animal diluído. Aqui está o nervo óptico na parte traseira do olho oposto.

Essa é a córnea. A íris é visível através da córnea. A área esbranquiçada na parte posterior do olho é a esclera.

Portanto, essa região é chamada de divisão córneo-escleral. O primeiro passo da dissecação é remover tecidos estranhos, como tecido conjuntivo muscular e o nervo óptico. Em seguida, a córnea deve ser removida, fazendo um corte circular.

Neste ponto, a lente pode ser removida, resultando em uma cúpula ocular oca. Em seguida, quatro cortes são feitos a partir da divisão córneo-escleral em direção ao disco do nervo óptico. A estrutura resultante assemelha-se a uma flor com quatro pétalas.

Cada uma dessas quatro pétalas é então cortada ao meio, resultando em uma estrutura que se assemelha a uma flor de oito pétalas. Nesta etapa, o I pode apresentar ondulações em algumas áreas devido à sua natureza esférica. Para combater isso e obter uma montagem de orifício mais plana, você pode fazer oito cortes mais curtos logo após a ondulação.

Você precisará ter vários materiais prontos em sua estação de trabalho, incluindo uma pipeta de 100 ou 200 p e respectivas ponteiras, lâminas com lamínulas X-P-B-S-A de 35 milímetros, glicerol a 90% e esmalte incolor para o preparo das lâminas, um suporte para secar as lâminas, uma caixa de lenços Kim e um recipiente de descarte de resíduos. Além desses materiais comuns, você também precisará de um conjunto de ferramentas especializadas para microdissecação, incluindo pinças retas e pinças anguladas em 45 graus, usadas para segurar, girar e manipular geralmente o olho durante toda a dissecação. Essas pinças de 15 graus têm um ângulo ascendente e também são utilizadas para manusear e manipular o olho.

Por fim, você precisará de um par de tesouras de mola. É muito importante que você use tesouras de mola em vez de tesouras do estilo tradicional. Para esta dissecação, antes de começar a dissecação, certifique-se de que a altura da sua cadeira esteja ajustada de modo que, quando você estiver sentado ereto, seus olhos fiquem no mesmo nível dos oculares.

Curvar-se sobre o microscópio causa dor nos ombros e nas costas e prejudica a qualidade de suas dissecações. Para começar, despeje um XPBS na tampa da placa de 35 milímetros. Em seguida, transfira os olhos que você pretende dissecar para a placa.

Este é um olho de um camundongo selvagem tipo C57 preto. Você pode observá-lo como sendo muito pequeno, com cerca de três milímetros e meio de diâmetro. A opacidade da esclera confere a ele uma tonalidade azulada.

O primeiro passo na dissecação é remover todos os tecidos extranhos ao redor do olho, como o tecido conjuntivo muscular e o nervo óptico. Aqui, tenho a pinça de 45 graus na mão esquerda e a pinça de 15 graus na mão direita. Você pode usar um par de pinças para imobilizar o olho enquanto puxa o tecido com a outra.

Quando um pedaço grande de tecido se soltar, limpe cuidadosamente sua pinça em um lenço Kim. Apenas tenha cuidado para não esmagar ou perfurar o olho. Um dos benefícios de realizar essa dissecação em suspensão é que é possível visualizar facilmente o tecido conjuntivo se afastando do olho.

Eventualmente, você atingirá um ponto em que não poderá remover mais tecido usando pinças. Substitua suas pinças com ângulo de 15 graus por tesouras de mola. Use as tesouras de mola para cortar o nervo óptico.

Use a borda externa da lâmina para empurrar o tecido para frente, em direção à junção córnea-escleral. Em seguida, corte e limpe suavemente as tesouras em um lenço de papel. Vamos observar isso novamente.

Empurre o tecido para frente, em direção à junção córneo-escleral, com a borda externa da sua tesoura quando o tecido estiver saliente. Corte, continue empurrando pedaços de tecido para frente com a borda romba da tesoura e depois remova-os até que todo tecido extranumerário seja eliminado. Geralmente há duas faixas de tecido resistente no olho.

O primeiro está fixado na junção esclerocorneana, e o segundo está sendo mostrado durante o corte. Aqui está aproximadamente na metade do caminho entre a junção esclerocorneana e o disco do nervo óptico. O próximo passo na dissecação é remover a córnea e o cristalino.

Use sua pinça de 45 graus para levantar uma aba aproximadamente no meio da córnea. Em seguida, use sua tesoura de mola para fazer uma pequena incisão na base da aba. Insira a lâmina inferior da tesoura na incisão, sob a íris.

Realize um corte em direção, mas não dentro, da divisão córneo-escleral. Agora, gire lentamente o olho 360 graus, fazendo pequenos cortes ao redor. Tente manter a tesoura sob a íris, cortando ao mesmo tempo a córnea e a íris.

É preciso muita prática para fazer isso com tanta facilidade quanto mostro aqui. Uma vez removida a córnea, vire o olho de lado e pressione suavemente a parte externa do olho, expulsando a lente. A estrutura restante terá, a seguir, forma semelhante a um copo.

O olho deve ser dividido em quartos. Para fazer isso, vire o olho de lado e insira a lâmina inferior da sua tesoura de mola. Faça um corte longitudinal em direção ao disco do nervo óptico, mas sem atingi-lo completamente.

Para fazer isso, mantenha os braços ao lado do corpo e as tesouras à sua frente, aproximadamente perpendiculares ao seu corpo e ao corte no olho. Faça o segundo corte diretamente oposto ao primeiro corte. Tome seu tempo para alinhar corretamente, de modo que possa realizar um corte suave.

Realizar múltiplos cortes pode causar irregularidades, mas se alinhados cuidadosamente, não são perceptíveis; observe como consigo trabalhar com essa forma esférica do olho, em vez de contra ela, porque o olho mantém sua forma normal. Quando suspenso em PBS, o restante da dissecação será realizado em uma lâmina. Segure o olho com sua pinça em ângulo de 45 graus e levante-o para fora do PBS.

Coloque o olho em uma lâmina nova. Usando os dois pares de pinças anguladas, desdobre cuidadosamente o olho. Observe que há uma pequena margem de córnea e íris ao redor da periferia do olho, o que é útil para manipulação.

Em seguida, você precisa cortar cada um dos quatro pedais ao meio. Gire o olho de modo que um dos pedais fique perpendicular ao seu corpo. Segure o canto do pedal com a pinça em um ângulo de 15 graus.

Levante levemente e, em seguida, faça um corte a partir da junção córneo-escleral em direção ao disco do nervo óptico. Esses cortes devem ser perpendiculares a uma tangente. Uma tangente é uma linha que é perpendicular ao diâmetro.

Portanto, seus cortes devem estar alinhados com o diâmetro do olho. Agora, gire a lâmina para que o próximo pétalo fique perpendicular ao seu corpo e repita. Segure a extremidade do pétalo.

Levante levemente e corte. Repita até que cada um dos quatro grandes pedículos tenha sido cortado ao meio. A substância esbranquiçada é a retina neural, que recobre diretamente o EPR.

A retina neural pode proteger o EPR, portanto deixe-a intacta até que todos os seus cortes tenham sido feitos. Observe como as pétalas são ligeiramente curvas. Não resista a isso.

Tenha calma para alinhar corretamente e poder fazer um único corte preciso. Como o olho é redondo, tem tendência a dobrar; para evitar esse encurvamento, você pode fazer oito cortes rápidos.

Um em cada pétala. Utilize a mesma estratégia básica da rodada anterior de quatro cortes. Levante o canto do pétala e corte, mas neste caso, corte apenas cerca da metade do comprimento do pétala.

Depois de fazer todos os cortes, você pode remover a retina neural. Aqui estou adicionando algumas gotas de PBS 1X ao espécime. Você não deve deixar seu epitélio pigmentado da retina secar.

A retina neural deve estar apenas fracamente associada ao epitélio pigmentado da retina subjacente. É possível observar que ela se solta com bastante facilidade. No entanto, geralmente permanecerá aderida na divisão córneo-escleral, que, na parte interna do olho, é uma crista irregular chamada corpo ciliar.

Você pode inserir a ponta de sua pinça de 15 graus no disco do nervo óptico para fixar o espécime enquanto remove a retina neural. O corpo ciliar marca a borda do epitélio pigmentado da retina (RPE), o tecido fortemente pigmentado que foi removido. Aqui está a íris, não o RPE.

Recomendo remover o máximo possível da íris, pois ela é muito aderente e pode dobrar e grudar no epitélio pigmentado da retina (RPE) se a retina neural estiver esfoliando ou se restos dela permanecerem aderidos ao RPE. Provavelmente ocorreu um de dois problemas: ou os olhos não foram fixados corretamente, por tempo excessivo ou insuficiente, ou permaneceram em armazenamento por muito tempo antes da dissecação.

O pedal que estou revelando aqui ainda não possui seu atalho. É possível observar como o pedal está a cerca de um terço do caminho a partir da borda da RPE. Por isso são recomendados os oito atalhos.

Após descartar toda a Retina neural, use uma pipeta para lavar o epitélio pigmentado da retina (RPE) várias vezes com 100 a 200 microlitros de PBS até que toda a poeira e detritos tenham sido removidos. Pipete 80 a 90 microlitros de glicerol a 90% sobre uma lâmina limpa, em formato retangular. Observe que este é o volume ideal de glicerol para um lamínula de 22 por 50 milímetros e deve ser ajustado conforme necessário.

Para outros tamanhos de lamínula, use a ponta da pipeta para espalhar o glicerol. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no glicerol. Caso apareça uma bolha, arraste-a até a borda, onde ela irá estourar.

Deslize o braço inferior da pinça de 15 graus sob o EPR e levante com cuidado, abaixando lentamente o EPR no glicerol. O EPR flutuará na superfície do glicerol e poderá enrolar ou torcer um pouco. Use a pinça para alinhar o EPR e para arrastar o glicerol sobre a superfície do EPR.

Se bolhas de ar se formarem, enquanto faz isso, mova-as até a borda, onde estourarão, segurando o lamínula em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Toque-a na borda do glicerol.

Em seguida, mova-o em direção à borda da lâmina. Segure a parte inferior do lamínula com o polegar e o indicador e apoie a borda oposta com a pinça de 15 graus. Abaixe lentamente o lamínula em direção à lâmina assim que o contato for estabelecido.

Com o EPR, pare de abaixar, permitindo que o glicerol migre enquanto você continua a abaixar lentamente a lamínula. Se você abaixar a lamínula muito rapidamente, bolhas de ar serão incorporadas à sua lâmina neste ponto. Vou abaixar lentamente a lamínula ao tocar o EPR e permitir que o glicerol migre.

Você pode observar que, quando solto rapidamente o lamínula, bolhas de ar são incorporadas. Use uma quantidade generosa de esmalte incolor para fixar a borda do lamínula ao lâmina, contornando completamente todo o perímetro.

Este é um epitélio pigmentado da retina (EPR) típico de um camundongo preto C57. É normal observar a vasculatura subjacente, conforme indicado aqui. Também é normal observar alguma variação na pigmentação, como manchas que parecem menos pigmentadas.

No entanto, manchas claras como esta provavelmente são decorrentes de danos físicos ao epitélio pigmentado da retina (RPE) e à coroide subjacente. Como a coroide do olho também é pigmentada, é possível que danos em um RPE escuro passem despercebidos se a coroide permanecer intacta.

Este é um RPE típico de um camundongo diluído. Como indicado, você será capaz de visualizar a vasculatura e haverá alguma variação na pigmentação, como manchas mais escuras e manchas mais claras. No entanto, é quase impossível observar danos em um RPE diluído.

Essas pequenas manchas são danos ou variações normais na pigmentação? Sugerimos fixação e coloração para responder a essa pergunta. Isso dará uma ideia se você está manipulando o tecido com muita aspereza.

A coloração delinea claramente as membranas celulares, tornando evidentes os pontos danificados, mas, na realidade, o epitélio pigmentado da retina (RPE) é bastante resistente, e se você manipular o olho pela córnea, é improvável que cause danos. Aqui há uma preparação em montagem inteira com uma série de problemas, sendo o menor deles indicado aqui como uma margem excessivamente ampla de córnea, o que pode levar ao enrugamento e dobramento do material ondulado. Pode-se observar aqui um tecido extranumerário maciço ainda presente na parte posterior do olho.

Este pedal está parcialmente dobrado, e aqui você pode ver que o EPR foi parcialmente rasgado. Outro problema é que este olho tem a aparência de uma cata-vento. Aqui desenhei os ângulos dos cortes.

No entanto, é assim que eles deveriam estar. Lembre-se, seus cortes devem ser perpendiculares à tangente e alinhados com o diâmetro. Acabei de demonstrar como dissecar um olho de camundongo para um preparo inteiro do epitélio pigmentar da retina.

Epitélio, a coisa mais importante é manter uma boa postura, mas tente permanecer relaxado. Espero que você tenha achado este vídeo útil e desejo a você todo o sucesso em seus futuros experimentos.