Name: Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprenda a criar culturas organotípicas cerebelares para estudar apoptose em células de camundongos selvagens e mutantes. Este método permite analisar a viabilidade celular e respostas ao ligante fast por imunofluorescência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi financiado em parte pela Fundação IPSEN. IMV é um Professor Sociedade Americana do Câncer da Biologia Molecular, e detém o Irwin Jacobs e Joan Presidente em Ciências da Vida Exemplar. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do NIH, Fundação Leducq, Fundação Meriaux, Medicina Ellison Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Câncer de Próstata Foundation, eo HN e Frances C. Berger Foundation. PAS é financiado pelo Fundo de Dotação McKnight de Neurociências e do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (R01 DA019022). Os autores gostariam de agradecer a Mark Schmitt. Arte gráfica foi desenhada por Jamie T. Simon. Patrocínio foi gentilmente cedido pela Invitrogen.

1. Organotípicas Culturas Cerebelar: <ol><li> Para conseguir gerar organotípicas culturas cerebelar usar mouses entre P0-P3 ou P8-P12. Para nosso experimento utilizamos ratos na faixa P8-P12, porque nesta fase de desenvolvimento era mais apropriado para o nosso estudo. </li><li> Prepare a dissecção eo meio de cultura: <ol><li> Dissecção do cérebro e preparação fatia são realizados em baixa de sódio líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo 1mM de cloreto de cálcio, 10mM D-Glicose, 4 mM de cloreto de potássio, cloreto de magnésio 5mM, bicarbonato de sódio 26mm, 246 mm de sacarose e solução de vermelho de fenol (1:1000) , pH 7,3. Para esterilizar a solução, filtrá-la através de um filtro 0,22 mm e armazenar a 4 ° C. </li><li> Fatias cerebelar são cultivadas em 75% Mínimo Essencial Medium Eagle (MEM), soro de cavalo 25% inativado pelo calor, HEPES 25 mM, 1mM glutamina, 5mg / mL de glicose, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (100 U / mL). Filtrar o meio através de um filtro de 0,22 mm e armazenar a 4 ° C para um máximo de duas semanas. </li></ol></li><li> Dissecar o cérebro na gelada médio ACSF previamente aeradas com carbogênio (95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5%) Note, que a saturação com carbogênio vai mudar o pH da solução para que ele irá mudar de vermelho para laranja. A dissecção deve ser realizado, no montante mínimo de tempo possível tomando cuidado para não danificar a estrutura do cérebro. </li><li> Fatia do cérebro em cortes sagitais de 400 m usando uma vibratome. <ol><li> Faça um corte sagital com uma lâmina de barbear em um hemisfério, tentando cortar o mínimo possível do cerebelo, o que irá proporcionar uma superfície plana para corte. O córtex é apenas usado para apoio para fazer o corte mais fácil, mas como o tempo é uma questão importante, é mais conveniente para cortar a metade rostral do córtex com uma lâmina de barbear. </li><li> Use cianoacrilato (Superglue) para fixar a posição do cérebro no prato vibratome metal. É importante para refrigerar a placa de gelo antes de adicionar a cola e espalhe bem com a ponta do tubo para formar uma camada adesiva fina. Se houver um excesso de Superglue, ele irá retirar do prato quando entra em contato com a ACSF ea amostra será perdido. </li><li> Uma vez que o cérebro está ligado à placa vibratome, adicionar mídia o suficiente para cobrir ACSF o cérebro e colocar gelo abaixo da placa para mantê-lo frio. </li><li> Cortar fatias 400 mm e transferi-los com um plástico Pasteur pipeta (cortar a ponta para alargá-la e evitar danos às fatias) para uma placa de cultura de 6 bem célula que contém ACSF no gelo. </li><li> Separar o cerebelo do resto do cérebro com a ajuda de duas seringas de insulina (seringas com diâmetro pequeno calibre 28 agulhas) sob o microscópio de dissecação. Algumas fatias terá Superglue anexado às bordas: este é o momento para tentar removê-lo, pois ele pode afetar a viabilidade da fatia. É importante fazê-lo cuidadosamente sem danificar a estrutura do cerebelo. </li></ol></li><li> Transferir as fatias cerebelar a 6 bem-placas contendo insere placa 30 milímetros cultura com 0,4 mM poros. Adicionar 1 mL de meios de cultura por poço, que foi pré-condicionado por incubação por pelo menos 2 horas a 37 ° C e 5% CO 2 (na cultura de células incubadora). Coloque o insere no topo da mídia certificando-se que não há bolhas de ar presas debaixo e em seguida, coloque as fatias de cerebelo (1-3 por pastilha) em cima das inserções ter certeza que eles estão totalmente estendida, e que o líquido não está cobrindo-los. Aspirar o excesso de meios de comunicação, se necessário. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 mudando o meio de cultura a cada 2 ou 3 dias. O melhor é substituir apenas uma parte do meio (por exemplo, volume de ½) de uma só vez, desde meio utilizado contém fatores fatia derivados tróficos que são importantes para a sobrevivência da célula. </li></ol> 2. Tratamento Fas e coloração das fatias Cerebelar: <ol><li> Para o experimento desafio apoptose, primeira cultura que as fatias por 5 dias em mudança de mídia no dia in vitro 3 (Div3). Em DIV5 culturas são tratadas com 0,5 mg / mL do anticorpo Jo2 Fas agonista, adicionando-o diretamente para a mídia, a fim de ter um fundo limpo de morte celular desde as mudanças dos meios de comunicação podem induzir alguma mortalidade nas culturas. Metade dos poços são deixados sem tratamento como controle. </li><li> Após 24 horas remova a mídia sob as inserções por sucção. Para corrigir as fatias, adicione 1 mL de gelo frio PFA 4% abaixo e acima da 1 mL de inserção. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após 10 minutos retire a PFA e lave brevemente com PBS frio. </li><li> Em seguida remova o PBS e adicionar 1 mL por baixo e 1 mL acima da inserção de 20% de metanol gelado em PBS e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lave novamente com PBS e adicionar 1 mL e 1 mL por baixo acima da inserção de 0,5% de 100 Triton-X em PBS para permeabilização. Incubar por um mínimo de 12 horas a 4 ° C. </li><li> Depois de permeabilização, bloco com 20% BSA em PBS por um mínimo de4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Nesta fase as fatias podem ser mantidos em solução de bloqueio por pelo menos 3 dias a 4 ° C. </li><li> De modo a manchar as fatias de corte cuidadosamente o pedaço da membrana inserir anexado à fatia do cerebelo e transferi-la para placas de 24 poços contendo PBS. </li><li> A imunocoloração é feito sequencialmente, primeiro com o reagente TUNEL por uma hora e, em seguida, com anticorpo Calbidin durante a noite. <ol><li> Aspirar o PBS e adicionar 250 mL de reagente off TUNEL em cada poço ter certeza que ele cobre toda a superfície da fatia. Incubar a 37 ° C por uma hora no escuro. </li><li> Após uma hora retire a mistura TUNEL e lavar com PBS três vezes por 10 minutos. </li><li> Após a última lavagem, remover o PBS e adicionar 250 mL de uma diluição 1 / 1000 do anticorpo calbindina em PBS e incubar overnight a 4 ° C no escuro. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário e lavar com PBS três vezes por 10 minutos. </li><li> Adicionar mL 250 de anticorpo secundário diluído 1 / 500 em PBS e incubar por pelo menos três horas à temperatura ambiente no escuro. O kit TUNEL usamos é rotulado com TMR vermelho, pois o nosso anticorpo secundário para calbindina é conjugado com Alexa-488. </li><li> Lavar três vezes por 10 minutos com PBS e monte as fatias em uma lâmina de vidro usando uma mídia de montagem que contém DAPI. </li><li> Imagem as fatias com um microscópio confocal usando a 488 nm e 561 nm comprimento de onda de excitação para calbindina e TUNEL, respectivamente. </li></ol></li></ol> 3. Resultados representativos: O desafio principal deste protocolo deve ser capaz de gerar saudável culturas fatia cerebelar, especialmente desde a nossa leitura final será a morte celular. Uma cultura saudável aparece como aquele onde a camada de células do corpo é translúcido e permite que você veja a estrutura foliated do cerebelo sob o microscópio (Figura 1). Depois de alguns dias em cultura as fatias de começar a células finas e não-neuronal pode ser observado a migração para fora das margens da fatia. As células redondas escuras (mais provável macrófagos) que cobrem as fatias depois de alguns dias em cultura, acabará por diminuir em número após 10-14 dias in vitro (Figura 2) 5. A prova final para a viabilidade das fatias é a mancha para diferentes marcadores celulares, como calbindina para as células de Purkinje. A Figura 3 mostra uma imagem de microscópio confocal representante da camada de células de Purkinje com núcleos TUNEL várias positivo. É importante considerar que, mesmo se algumas fatias recebeu um estímulo apoptótico, eles só foram expostas por 24 horas. Isto permitiu tempo suficiente para observar fragmentação do DNA nas células morrendo com a coloração TUNEL, mas uma camada de células Purkinje definido ainda estava presente. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fatia cerebelar saudável em div2. Esta imagem mostra a camada de células do corpo translúcido ea estrutura foliated cerebelar em uma fatia saudável. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fatia cerebelar saudável em DIV 7. Nesta imagem ainda podemos observar a estrutura foliated do cerebelo e do aparecimento de corpos celulares escuro. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagem representativa de uma fatia Fas-tratados cerebelar. Esta imagem confocal mostra as células Purkinje corados com calbindina (verde) e as células apoptóticas TUNEL positivas para a coloração (vermelho). Células de Purkinje não aparecem em uma única linha, mas estão agrupados formando uma estrutura folium-like.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

Todo o trabalho foi feito com animais conduzidos de acordo com as políticas estabelecidas pelo IACUC. O Instituto Salk é uma facilidade AAALAC credenciados.

Este método descreve uma das muitas aplicações possíveis de culturas organotípicas neuronal e nos permitiu estudar o efeito dos estímulos apoptóticos no tipo selvagem e mutante fatias de cerebelo. A parte mais crítica desta experiência é ser capaz de gerar consistentemente saudável culturas fatia cerebelar. Os factores chave são dissecção e técnica de corte e a capacidade de executar o protocolo no menor tempo possível, mas ao mesmo tempo, tomando cuidado para não danificar as fatias. Outro fator crucial é a preparação ea composição do meio de cultura, essas culturas são muito sensíveis, por isso tivemos de testar várias receitas e marcas de mídia. Mesmo diferentes lotes de soro ou quaisquer outros componentes dos meios de comunicação podem afetar a viabilidade das fatias. Nós temos os melhores resultados com o soro de cavalo de Invitrogen Lot # 480116. Uma vez que as fatias de cerebelo são gerados pode-se estudar o desenvolvimento do cerebelo, eletrofisiologia, a sobrevivência da célula isolada ou em resposta a estímulos apoptóticos, excitotoxicidade ou privação de oxigênio. Estudos comparativos utilizando tipo selvagem e mutante fatias cerebelar foram muito perspicaz em muitos aspectos da função cerebelar e desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 6 poços / 24 poços</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura com inserts de 30 mm (0,4-&amp;mu;m poro</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) purificado NA/LE</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; kit de detecção de morte celular, TMR vermelho</td><td>Grupo Roche</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Calbindina D-28k de coelho</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secundário Alexa 488-anticorpo de cabra anti-IgG de coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Montagem Vectashield com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotípicas culturas cerebelar: desafios apoptotic e detecção

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotípicas culturas de tecido neuronal foram introduzidas pela primeira vez em 1947 1,2 Hogue, que constituíram um grande avanço no campo da neurociência. Desde então, a técnica foi desenvolvida e, atualmente, existem muitas maneiras diferentes de preparar culturas organotípicas. O método apresentado aqui foi adaptada da descrita por Stoppini et al. Para a preparação das fatias e de Gogolla et al. Para o procedimento de coloração 3,4. Uma característica exclusiva desta técnica é que ele permite que você estude as diferentes partes do cérebro, como hipocampo ou cerebelo em sua estrutura original, proporcionando uma grande vantagem sobre as culturas dissociadas em que toda a organização celular e redes neuronais são interrompidos. No caso do cerebelo é ainda mais vantajosa, pois permite o estudo das células de Purkinje, extremamente difícil de obter como cultura principal dissociados. Este método pode ser usado para estudar algumas características de desenvolvimento do cerebelo in vitro, bem como para experimentos eletrofisiológicos e farmacológicas, tanto do tipo selvagem e camundongos mutantes. O método descrito aqui foi projetado para estudar o efeito dos estímulos apoptóticos, tais como ligante Fas no cerebelo em desenvolvimento, usando coloração TUNEL para medir a morte celular por apoptose. Se a coloração TUNEL é combinada com o tipo de marcadores celulares específicos, como calbindina de células de Purkinje, é possível avaliar a morte celular de uma forma população de células específicas. A coloração calbindina também serve o propósito de avaliar a qualidade das culturas de cerebelo.

Este método descreve a geração de organotípicas culturas cerebelar eo efeito de determinados estímulos apoptóticos sobre a viabilidade de diferentes tipos de células do cerebelo.

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Culturas organotípicas de tecido neuronal foram introduzidas pioneiramente por Hogue em 1947 1,2 e constituíram um avanço fundamental no campo da neurociência. ...

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar o efeito do estímulo apoptótico fast ligand no cerebelo em desenvolvimento de camundongos selvagens e mutantes. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do cérebro de camundongos selvagens e knockout entre os dias pós-natais oito e 12. O segundo passo consiste em cortar os cérebros em fatias com espessura de 400 micrômetros e isolar o cerebelo de cada fatia.O terceiro passo é cultivar as fatias cerebelares por cinco dias para garantir que estejam saudáveis antes de induzir a morte celular com o ligante rápido. O passo final do procedimento é analisar o efeito do ligante rápido nas diferentes populações celulares cerebelares de camundongos selvagens e knockout com base na coloração por imunofluorescência para o marcador apoptótico tunnel, combinado com marcadores específicos de tipo celular, como calbindina para células de Purkinje. A principal vantagem dos cultivos cerebelares vivos é que eles permitem a manutenção da estrutura regional cerebelar, ao contrário dos cultivos primários dissociados, nos quais as redes neuronais e várias organizações são interrompidas.Assim, este estudo permitirá responder a algumas questões fundamentais em neurociências, especialmente porque se dispõe do camundongo selvagem e do mutante. Dessa forma, pode-se analisar o desenvolvimento comparativo, estudar a fisiologia, bem como a eletrofisiologia e a farmacologia. Embora este método possa fornecer informações sobre a função do ligante rápido na sobrevivência celular ou cerebelar, ele também pode ser utilizado para investigar os efeitos do ligante rápido no córtex e no hipocampo.De modo geral, as pessoas novas neste método terão dificuldades porque, para obter uma lise cerebelar saudável, é fundamental colocá-las em cultura o mais rapidamente possível sem comprometer sua integridade. Portanto, é importante ter boas habilidades de dissecação e de corte antes de tentar todo o processo. Sempre que possível.Os passos do seguinte procedimento devem ser realizados em uma cabine de cultura de tecidos antes da dissecação. Prepare um meio de LCR para dissecação cerebral e preparação de fatias, bem como o meio de cultura de fatias, de acordo com o protocolo escrito, e armazene-os a quatro graus Celsius no dia da dissecação. Prepare placas de cultura de tecidos para o cultivo das fatias cerebelares.Adicione um mililitro de meio de cultura de fatias a cada poço de uma placa de seis poços. Em seguida, utilize pinças estéreis para colocar os insertos da placa de cultura em cada poço. Certifique-se de que não haja bolhas de ar aprisionadas sob o inserto.Coloque a placa de cultura em uma incubadora de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos duas horas para precondicionar o meio. Em seguida, borbulhe o meio ACSF gelado com gás carbogênio; a saturação do meio com carbogênio altera o pH da solução e produz uma mudança de cor de vermelho para laranja.Despeje um pouco do meio A CSF gelado e borbulhado em uma placa de Petri estéril e em uma placa de seis poços. Coloque-as sobre gelo junto com a placa do vibrátomo que será usada para cortar o cérebro. A placa de Petri contendo o meio A CSF gelado e borbulhado será usada para dissecar o cérebro de um camundongo filhote P8 a P12 após a dissecção.Use uma lâmina de barbear para fazer um corte sagital em um hemisfério, proporcionando uma superfície plana para fixação na placa de vibram. A parte rostral do córtex também pode ser cortada. Seque a placa de vibram gelada com uma toalha de papel.Em seguida, adicione um pouco de cola instantânea à platina e espalhe-a em um padrão zigue-zague com a ponta do tubo da cola. Para formar uma camada adesiva fina, use uma espátula para transferir o cérebro para a platina do vibratomo, com o lado achatado em contato com a cola instantânea. Uma vez que o cérebro esteja fixado à placa do vibratomo, adicione meio CSF suficiente para cobrir o cérebro e coloque gelo abaixo da placa para mantê-lo frio.Corte o cérebro em fatias de 400 micrômetros. Em seguida, use uma pipeta de plástico para massas com a extremidade cortada e alargada para transferir as fatias para a placa de seis poços contendo meio A CSF sobre gelo, trabalhando sob o microscópio estereoscópico.Utilize duas seringas de insulina com agulhas de diâmetro pequeno, 28 graus, para separar o cerebelo do resto do cérebro. Se alguma das fatias apresentar cola instantânea na borda, use as duas agulhas de seringa para remover a cola da fatia. Utilize a pipeta de plástico para macarrão com a extremidade cortada e alargada para transferir as fatias para o topo dos filtros.Adicionar de uma a três fatias por inserto garante que as fatias estejam totalmente estendidas e que nenhum líquido as esteja cobrindo. Se necessário, aspire o meio em excesso com a pipeta, incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Após 48 horas, substitua metade do volume do meio por meio fresco, certificando-se de que nenhuma bolha de ar fique presa sob o inserto.O meio original restante contém fatores tróficos derivados de fatias que são importantes para a sobrevivência celular. O desafio apoptótico é realizado após cinco dias de cultivo. Adicione o anticorpo agonista rápido JO dois ao meio de cultura celular nos poços a serem tratados.Deixe metade dos poços sem tratamento como controles. Após 24 horas, aspire o meio de cultivo de baixo dos poços. Em seguida, fixe as fatias pipetando um mililitro de paraformaldeído a 4% gelado sob o inserto e um mililitro de PFA sobre o inserto.Deixe as fatias fixarem no PFA por 10 minutos à temperatura ambiente após 10 minutos. Aspire o PFA e lave brevemente com dois mililitros de PBS frio usando pipeta. Adicione um mililitro sobre o inserto e um mililitro abaixo do inserto.Em seguida, aspire o PBS e pipete um mililitro de metanol a 20% gelado em PBS abaixo do inserto e um mililitro acima do inserto. Incube por cinco minutos à temperatura ambiente, depois aspire o metanol a 20% do poço e lave a fatia e o poço D com PBS. Como antes, pipete um mililitro de Triton X-100 a 0,5% em PBS sobre o inserto e outro mililitro abaixo do inserto.Incube por um mínimo de 12 horas a quatro graus Celsius para permitir a permeabilização dos cortes após a permeação. Aspire a solução de Triton X 100 a 0,5% em PBS e pipete um mililitro de BSA a 20% em PBS sobre o corte e um mililitro sob o corte. Bloqueie os cortes por um mínimo de quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius.Quando o bloqueio estiver completo, use uma tesoura limpa para cortar cuidadosamente o pedaço da membrana inserida no fragmento cerebelar. Em seguida, use pinças limpas para transferir o pedaço da membrana para uma placa de 24 poços contendo PBS, aspire o PBS e adicione 250 microlitros do reagente tunnel em cada poço, certificando-se de que o reagente cubra toda a superfície do fragmento.Incubar a 37 graus Celsius por uma hora no escuro; quando a hora terminar, aspirar o reagente do túnel dos poços e substituir por 500 microlitros de PBS. Proteger a placa da luz e incubá-la à temperatura ambiente por 10 minutos para lavar.Repita este processo duas vezes após a última lavagem. Aspire o PBS e adicione 250 microlitros de uma diluição um para 1000 do anticorpo contra calbindina em PBS e incube durante a noite a quatro graus Celsius no escuro. No dia seguinte.Aspire a solução de anticorpo primário e lave com PBS 3 vezes por 10 minutos. Em seguida, adicione 250 microlitros de anticorpo secundário diluído na proporção de 1:500 em PBS. Cubra a placa com papel alumínio para proteger da luz e incube por pelo menos três horas à temperatura ambiente após a incubação.Lave as fatias três vezes durante 10 minutos com PBS e utilizando meio de montagem que contenha dappy. Monte as fatias sobre uma lâmina de microscópio de vidro e cubra com lamínula. Imagem as fatias com um microscópio confocal utilizando os comprimentos de onda de excitação de 488 nanômetros e 561 nanômetros para kale, bendin e tunnel, respectivamente.Esta imagem mostra um corte cerebelar saudável. Após dois dias in vitro, a camada de corpos celulares aparece translúcida e a estrutura foliada do cerebelo é claramente visível ao microscópio. Após sete dias in vitro, a estrutura foliada do corte cerebelar saudável ainda é visível.Além disso, corpos celulares escuros, provavelmente macrófagos, geralmente cobrem a fatia. A imagem confocal exibida aqui é representativa de uma fatia cerebelar tratada rapidamente. As células bikini aparecem verdes após coloração com um anticorpo primário, seguido por um anticorpo secundário conjugado com Alexa 488.As células apoptóticas positivas para a coloração TUNEL aparecem vermelhas, pois o kit TUNEL utilizado é marcado com TMR. As células Bikini vermelhas não aparecem em uma única fileira, mas sim agrupadas, formando uma estrutura semelhante a um aglomerado durante a realização deste procedimento. É importante lembrar de trabalhar na câmara de cultura de tecidos sempre que possível e minimizar o tempo em que o tecido cerebral fica exposto a possíveis contaminantes, como bactérias ou fungos.Utilizando este procedimento, outros métodos podem ser aplicados a essas fatias, incluindo análises bioquímicas e eletrofisiológicas para fornecer informações adicionais sobre o conteúdo proteico, bem como a excitabilidade neuronal. Esta técnica foi originalmente desenvolvida para estudar o efeito da morte celular mediada rapidamente em células de Perkin que possuem mutações que afetam a via rápida. As células periais raramente sobrevivem em cultura primária.Portanto, este procedimento foi a melhor abordagem experimental. Espero que, após assistir a este vídeo, você tenha uma boa ideia de como preparar fatias do córtex cerebelar e de como se pode estudar os estímulos apáticos e seus efeitos sobre diferentes tipos celulares cerebrais.

organotypic-cerebellar-cultures-apoptotic-challenges-and-detection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Live-célula de imagem de caspase-3 apoptose mediada em imortalizado culturas N19-oligodendrócitos célula usando...

Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

Apresenta-se um protocolo que permite visualizar e para avaliar quantitativamente a morfologia da árvore dendrítico das células de Purkinje individuais crescidas em culturas organotípicas do cerebelo. Este protocolo destina-se a promover estudos sobre os mecanismos de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas.

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Este vídeo ilustra uma técnica para obter fatias organotípicas cerebelares do cérebro de um filhote de camundongo e cultivar as fatias em meio suplementado com nutrientes e fatores de crescimento para imitar o desenvolvimento cerebelar in vitro. Além disso, fatias cerebelares específicas são tratadas com um composto de teste e a capacidade neuroprotetora do composto é analisada usando uma técnica de coloração por imunofluorescência.

Analisando a sobrevivência das células de Purkinje em culturas de fatias cerebelares organotípicas

Este vídeo demonstra o método de identificação de neurônios de uma cultura mista de neurônios granulares cerebelares e células gliais usando coloração dupla com diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propídio (PI), onde os neurônios vivos aparecem em verde e os neurônios mortos aparecem em vermelho.

Avaliação da viabilidade neuronal em uma cultura de neurônios cerebelares por meio de coloração dupla

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Este protocolo descreve como medir com precisão a viabilidade neuronal usando fluoresceína diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) dupla coloração em neurônios cultivados cerebrais grânulo, uma cultura primária neuronal utilizado como um modelo in vitro em neurociência e neuropharmacology investigação.

Avaliação da Viabilidade Neuronal Utilizando Coloração Dupla de Iodeto de Diacetate-Propidium de Fluoresceína em Cultura de Neurônio de Granulado Cerebelar

Este protocolo descreve um método simples para isolar e neurônios de grânulo cerebral principal do rato (CGNs) de filhotes de 6-7 dias de idade, transdução eficiente de CGNs para perda e ganho de estudos de função, de cultivo e modelagem excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA, morte celular baixo potássio-induzida, danos ao DNA e estresse oxidativo usando o mesmo modelo de cultura.

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

Realizar experimentos in vitro para refletir as condições in vivo da forma mais adequada possível não é uma tarefa fácil. O uso de culturas celulares primárias é um passo importante para a compreensão da biologia celular em um organismo inteiro. O protocolo fornecido descreve como crescer com sucesso e cultura embrionária mouse neurônios cerebelares.

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

As culturas organotípicas da fatia são uma ferramenta poderosa para estudar processos neurodevelopmental ou degenerative/regenerative. Aqui, descrevemos um protocolo que modela a morte do neurodesenvolvimento das células purkinje em culturas de fatias cerebelares do rato. Este método pode beneficiar a pesquisa na descoberta de medicamentos neuroprotetores.

Purkinje Sobrevivência celular em culturas organotípicas cerebelares fatia

As células cerebelares de Purkinje (PCs) são particularmente sensíveis a deficiências na resposta a danos no DNA. Um protocolo é apresentado para a avaliação visual da dinâmica da resposta do PC ao dano ao DNA, que envolve a coloração de cadeias de poli(ADP-ribose) ligadas a proteínas dentro de culturas organotípicas cerebelares.

Visualizando a resposta ao dano do DNA em células de Purkinje usando culturas organotípicas cerebelares

Aprenda a criar culturas organotípicas cerebelares para estudar apoptose em células de camundongos selvagens e mutantes. Este método permite analisar a viabilidade celular e respostas ao ligante fast por imunofluorescência.

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Explorar mais vídeos