Name: Comportamento migratório de células geradas em culturas Eminence ganglionares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprenda a analisar o comportamento migratório de células da eminência ganglionar em culturas 3D usando imagens em lapso de tempo. Este método permite quantificar movimentos celulares individuais em resposta a extratos proteicos do córtex cerebral.

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Este trabalho foi financiado pelo DoD Grant PT074620 (SLJ) e Grant NIH R01NS245014 (SLJ).

1. Preparação de reagentes <ol><li> Descongele congelados no gelo Matrigel molhada, deixando tempo suficiente antes do experimento (não acelerar o processo de aquecimento ativo). Matrigel é usado para estabelecer um ambiente 3D muito parecidas com uma matriz extracelular propício para a migração de células. Ele fornece células com ambos um substrato e mecânicos que encerra. Matrigel é armazenado congelado a -20 ° C. Antes de usar, ele deve ser gradualmente trazidos para a temperatura de 0-4 ° C, ou seja descongelado em gelo triturado ou em uma geladeira. Matrigel irreversivelmente conjuntos para formar um gel na temperatura de incubação (37 ° C). Portanto, não é recomendado para acelerar o descongelamento por imersão do recipiente em água morna. </li><li> Frações protéicas são preparados por focalização isoelétrica (IEF) do extrato de proteína total do córtex cerebral pós-natal de dia 0 (P0) furão. Após a separação, as frações são dialisada durante a noite contra a 20mM Tris-HCl pH7.2 para limpar os extratos dos constituintes tampão foco, o que pode ser tóxico ao tecido. </li><li> Sistema de proteína de entrega. Proteínas extraídas do córtex cerebral são adsorvidas em esferas de látex fluorescentes que então liberam lentamente as proteínas para o environment.We descobriu que o recurso de fluorescência ajuda no tratamento visual de microesferas e permite fácil detecção do mesmo spillovers mínima do local de talão de depósito, quando observados em microscópio fluorescente. <ol class="lalpha"><li> Adicionar 10μl de contas fluorescentes para 100-200μl da solução de proteína </li><li> Incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente em um agitador </li><li> Girar a contas para baixo em uma centrífuga de bancada para a velocidade máxima de 1h </li><li> Remover o sobrenadante </li><li> Re-suspender em um vórtice utilizando 10μl de meio fresco </li><li> Adicionar 30μl de Matrigel à suspensão, misture bem, e colocar no gelo. </li></ol></li><li> Tampões e meios de comunicação <ol><li> Preparar e esterilizar-filtração do líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF; NaCl 124mm, 26mm NaHCO 3, NaH 2 PO 4 1,2 mm, 3,2 mm KCl, MgSO 4 1,2 mm, 2,4 mm CaCl 2, Glicose 10mM). Slush-congelar a ACSF de antemão, que ele está pronto no momento da dissecção dos tecidos. Para fazê-lo, coloque um frasco de plástico cheio de ACSF estéril em um freezer -80 C °. Monitor de congelamento de vez em quando, então, quando uma camada de gelo se acumula no interior da parede, quebrá-lo e misture com o líquido. Repita até que o frasco contém principalmente uma lama gelada. Buffer preparado desta forma não só apoia a sobrevivência do tecido, mas também irá realizar mais baixa temperatura, e é mecanicamente menos prejudicial para o tecido do que cubos de gelo chunky. </li><li> Prepare médio Neurobasal com N-2 e B-27 suplementos adicionados de acordo com sugestões do fabricante, bem como gentamicina 1mg/100ml, 2 mM L-glutamina e glicose 0,6%. Esterilizar por filtração através de uma membrana 0.22μm. Manter aquecida a 37 ° C até o uso. </li></ol></li><li> Placas de cultura <ol class="lalpha"><li> Cultura grade de plástico de seis pratos bem são preparados por dotting cada poço em seu centro com uma pequena quantidade (cerca de 2μl) de Matrigel frio utilizando 20μl ponta da pipeta, e colocando uma lamela de vidro autoclavados rodada 18 milímetros em cada gota. Nem as placas nem as lamelas necessidade de ser de outra forma de cultura, tratadas. </li></ol></li></ol> 2. Preparação dos tecidos <ol><li> A obtenção do tecido cerebral <ol class="lalpha"><li> Depois profundamente anestesiar o animal com Euthasol, remova o cérebro e colocá-lo na gelada ACSF </li><li> Separar os hemisférios com um bisturi e corte coronal em 500μm usando um dispositivo de escolha, coleta de fatias em um pequeno prato contendo gelada ACSF </li></ol></li><li> Explantes fazer (use microscópio de dissecação) <ol class="a"><li> Identificar fatias contendo as eminências ganglionares (GE) e regiões da guarnição do córtex que podem curvar sobre o GE e interferir com novas medidas </li><li> Pressione uma Harris Uni-Core furo na região próxima à superfície ventricular da GE, retraia um núcleo contendo predominantemente uma zona ventricular, e expulsá-lo com um êmbolo no meio gelada (Fig.1). Três a quatro explantes de 0,5 mm de diâmetro podem ser feitas a partir da GE na única fatia do cérebro P0 furão. Por favor, note que em ambos os roedores e ferrets, os GEs medial e lateral são fundidos nesta idade. Se um núcleo fica na fatia ou está preso ao fundo do prato de plástico, mobilizá-lo por esguichando ACSF com uma ponteira de pipeta e transferir com uma pipeta no prato contendo meio Neurobasal frio. Mantenha o prato sobre gelo molhado. </li><li> Transferência de um lote de explantes do meio em uma queda grande de gelado Matrigel (cerca de 0,25 0,5 ml) colocados em um prato separado, tendo o cuidado de ter os explantes totalmente imersa e evitando bolhas. Mantenha o prato sobre gelo molhado. O tamanho de um lote depende da velocidade do fluxo de trabalho a jusante. </li></ol></li></ol> 3. Configuração da cultura (uso de microscópio de dissecação) <ol><li> Manter sempre Matrigel e Matrigel contendo mistura no gelo para evitar a cura. </li><li> Remix da suspensão de esferas e coloque 1-2μl ou menos da suspensão de esferas na gelada Matrigel no centro de uma lamela de vidro previamente colocados em uma placa de cultura bem usando uma ponteira 20μl. Deixe-a definir um pouco, evitar a dessecação. </li><li> Usando uma ponteira 20μl pegar dois explantes da queda Matrigel e colocá-los nas imediações do depósito desejado talão (pelo menos um milímetro de distância da borda do depósito) simetricamente em lados opostos. Deixa por não mais de 5min à temperatura ambiente. O tempo certo de passos b e c é crítica. Se o tempo é curto demais ele irá levar a gelificação incompleta e componentes da instalação da cultura vai passar quando eles estão cobertos com a camada final de Matrigel; se o tempo é muito longo pode resultar em excesso de secagem do gel e criação de barreiras físicas que impedem a livre circulação das células. </li><li> Cobrir as contas e o explante com uma camada plana de cerca de 30μl de Matrigel, estendendo-o para além dos explantes (Fig.2). Deixe-a definir na incubadora por aproximadamente 15 minutos. </li><li> Adicionar 2ml de meio de Neurobasal com suplementos. </li><li> Incubar a 37 ° C em 5% de CO O 2 / 95% a atividade de monitoramento 2 migratórias diária. </li></ol> 4. Ao vivo de imagens <ol><li> Após a incubação por 3-4 dias, rever a placas de cultura e escolha lamínulas de interesse. Os explantes devem gerar uma nuvem radialmente uniforme de células. Substituir lamínulas escolhido em uma placa de cultura fresco que será usado na geração de imagens ao vivo. </li><li> Deixe as lamelas sentar-se no novo prato durante a noite. Antes de colocar a placa no microscópio para imagens, em uma capa de cultura de células, use uma espátula estéril para mover a lamínula, a fim de liberar qualquer microbolhas que recolhem entre a lamínula ea placa de cultura de células. Interferência de bolhas vai arruinar as imagens. Mover as lamelas para o centro do poço. </li><li> Para evitar a evaporação, preencher o espaço entre os poços com água. </li><li> Transferir cuidadosamente a placa da capa de cultura de células ao microscópio para não mover as lamelas do centro do poço. </li><li> Definir um esquema de imagens utilizando o software de imagem. Devido à natureza da configuração 3D cultura as células também se move na vertical, por isso, é importante recolher Z-aviões abrangendo profundidade total da nuvem de migração. A extensão XY de uma área analisada também deve ser suficientemente grande para cobrir áreas previsto para ser povoada com as células migram durante o curso de gravação, e para conter o depósito talão, a fim de gravar uma orientação angular do explante e células migram em relação ao a fonte de proteína. Considere também que os aviões mais fotografada Z, ou o mais área coberta, mais tempo leva para gravar um ciclo em um ponto determinado momento, forçando intervalos maiores de tempo entre amostras e uma perda de resolução temporal de rastreamento de celular. No nosso caso, utilizando objetiva de 10x, o esquema ideal era uma gravação de azulejos de 3x3 para cada um dos 10 Z-aviões espaçadas a cada 20Hm, em intervalos de 30min. Encontrámos 30 min intervalos mais longos do que permite a identificação inequívoca das células em momentos consecutivos, o que é crítico para o rastreamento confiável de seus movimentos. </li><li> Iniciado imagem lapso de tempo. </li><li> Após o tempo desejado, retire a placa e corrigir as culturas em 4% tamponado paraformaldeído. Ele pode ser usado para análise posterior morfológicos e imunocitoquímicos. </li></ol> 5. Análise do movimento <ol><li> Converter a série de tempo de gravação de imagens em um formato mais conveniente para processamento posterior, TIFF sendo a mais portátil. </li><li> Rastrear o movimento de células individuais ao longo do tempo por coordenadas XY de gravação. Isto pode ser feito usando o software disponível gratuitamente como ImageJ (NIH), com um Tracking Manual plug-in, ou qualquer outra aplicação comercial, como ImagePro, Volicity ou Autoquant. </li><li> Plot as faixas usando o Excel ou in-house software desenvolvido. </li><li> Para cada célula rastreado calcular parâmetros cinéticos como velocidade média, a curvatura do caminho, a variabilidade direcional ao longo do tempo, a ramificação, o desvio em direção à fonte de proteínas, cálculos, etc pode ser feito em MS Excel ou qualquer planilha equivalente. Nossa experiência indica, porém, que é muito mais produtivo para o desenvolvimento in-house scripts (usando R, Matlab, Python, Perl ou outras linguagens em sua imensa parte), pois eles permitem uma maior personalização flexível e inclusão de mais sofisticado do que os métodos analíticos disponíveis em uma instalação básica do Excel. </li></ol> 6. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama do origi anatômicasn de explantes. Este é um desenho de um corte coronal do cérebro ferret hemisected. Os círculos cinza indicam a região a partir do qual os explantes foram tomadas. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Diagrama de uma configuração de cultura. O depósito de talão é a fonte de proteínas; os explantes são colocados de ambos os lados e todos os elementos são cobertos com Matrigel. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Parcelas correspondentes de faixas de células coloridas por quadrantes (flechas apontam para o depósito talão). As faixas de células à direita estão migrando em direção a fração D, que parece atrair as células, as células do lado esquerdo estão migrando para fração A, que aparece para repelir as células migratórias. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. A) Uma série de imagens de timepoints selecionados mostrando uma nuvem de crescimento de células a migrar para fora de um explante. Uma célula exemplo, indicado por uma seta, é monitorado através do tempo, conforme indicado abaixo (barra de escala 200μm). Este explante foi visualizado com imagens ao vivo por 38 h. Mostrados aqui são imagens de células deixando o explante a partir do início da gravação das imagens para a imagem final. B) A célula indicada na parte A nos horários indicados. A célula mostra a ramificação repetitivos (barra de escala de 50 ìm).

<ol><li>Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cortical+development%3A+a+view+from+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li>
<li>Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li>
<li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li>
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<li>Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li>
<li>Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li>
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<li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li>
<li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li>
</ol>

Uso de animais: Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a USUHS e diretrizes institucionais NIH e aprovado pelo IACUC USUHS.

Aqui apresentamos um sistema simples para estudar e analisar o comportamento migratório de células neuronais em resposta a estímulos químicos. Em ensaios de migração in vitro têm sido usados ​​para identificar as moléculas extracelulares que afetam a locomoção de células. Nosso paradigma garante que cada célula estudada tem um ambiente 3-dimensional (3D) com os quais interagem. É uma vantagem considerável sobre as culturas onde as células migram para fora de explantes são forçados a mover-se sobre a superfície plana de poli-D-lisina revestido lamela, portanto, desprovida de interações com a matriz extracelular (por exemplo, Hirschberg et al &#39;10;. 8. Metin et al. &#39;07). No entanto, com relação à maior escala de rastreamento de células migratórias, continua a ser de 2 dimensões, como as células são verticalmente restrito ao espaço entre as lamelas de vidro na parte inferior e a superfície superior do Matrigel, que é relativamente fina em comparação com a liberdade horizontal da migração. Tal configuração permite a fácil análise do movimento, que ainda permanece essencialmente 2-dimensional. Similar paradigmas 3D consistindo de explantes GE ou re-agregados de células GE embutidos em colágeno ou Matrigel, anteriormente empregado, utilizando agregados de células que expressam uma determinada proteína de sinalização como uma fonte de pistas químicas (por exemplo &#39;07 Liodis et al;. Martini et .. al &#39;09;. Nóbrega-Pereira et al 08; Wichterle et al &#39;03).. O método aqui apresentado utiliza um sistema de liberação lenta na forma de esferas de látex com proteínas aderido para permitir um nível sustentado no ambiente local, que é maior do que proteínas adicionado diretamente ao meio, tornando o sistema particularmente adequado quando a quantidade de disponíveis proteína é limitado ou quando uma mistura complexa de proteínas é testada. A escolha de contas não se limita ao látex à base de produtos, e inclui também outros materiais, por exemplo, contas de agarose, cada um com características diferentes. Para aumentar ainda mais a densidade do ensaio, foram utilizados dois explantes apposed ao depósito contas em lados opostos. Para garantir uma área específica de origem, temos usado explantes eminência ganglionar como fonte de células. Foram avaliadas diferenças em porções medial e lateral da eminência ganglionar, mas não vejo qualquer diferença. Devemos salientar que este estudo utiliza furões; nesta espécie as eminências medial e lateral ganglionares fusível mais cedo do que em roedores (Poluch et al 08.). No momento em que as culturas foram feitas (P0) as eminências ganglionares medial e lateral foram fundidos, embora muitas células preencher o neocórtex ainda estão sendo gerados e migração. No entanto, se uma fonte verdadeiramente homogênea de células é preferível, uma suspensão de células pode ser preparado a partir do tecido dissecado e diretamente misturado com o Matrigel, ou, alternativamente, girou para baixo e uma pelota resultando perfurado para fazer &quot;explantes&quot;. Uso de digestão enzimática do tecido para preparar a suspensão celular é desencorajado, pois mesmo resíduos de atividade proteolítica pode liquefazer Matrigel ao longo do experimento. Além disso, uma diligência tem de ser aplicado para o momento da instalação da cultura. Embora Matrigel requer um período de aquecimento para polimerizar, mesmo período um pouco prolongado de exposição de pequenas gotas de Matrigel (como utilizado neste protocolo) para o ar faz com que a secagem e resulta em um shell que é impenetrável para as células migram e que não podem ser apagados cobrindo posterior com Matrigel fresco.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </td><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Médio Neurobasal (1X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 suplemento (100X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Suplemento (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085-SA </td><td></td></tr><tr><td> BD Matrigel Matrix Membrana Basal </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> Harris Uni-Core, tamanho 0,5 milímetros </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 69036-05 </td><td> Soco furo </td></tr><tr><td> Verde Retrobeads IX </td><td> Lumafluor, Inc. </td><td></td><td> Microesferas de látex </td></tr></tbody></table>

comportamento migratório de células geradas em culturas eminence ganglionares

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Migração de células é um processo comum que leva ao desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central de vertebrados (Hatten, 99). O córtex cerebral é composto por dois tipos básicos de neurônios: excitatórios e inibitórios. Essas células surgem em áreas distintas e migrar para o córtex ao longo das rotas diferentes (Pearlman et al., 98). Interneurônios inibitórios migrar tangencialmente a partir de fontes subcortical, principalmente a partir de diferentes regiões do eminências ganglionares (Gelman et al, &#39;09;. Xu et al, &#39;04).. Seu movimento espaço-temporal requer um controle preciso impostas por estímulos ambientais, para permitir o estabelecimento de adequada citoarquitetura e conectividade no córtex cerebral (Caviness &amp; Rakic, 78; Hatten, &#39;90; Rakic, &#39;90). Para estudar o comportamento migratório de células geradas em zonas proliferativa das eminências ganglionares (GE) em furões recém-nascido in vitro foi utilizado um arranjo de três dimensões em uma cultura Matrigel BD Matrix. A configuração de cultura consistiu em dois explantes GE e uma fonte de proteínas testadas extraído do córtex cerebral e adsorvido em fluorescentes Retrobeads latex IX posicionado entre os explantes (Hasling et al, &#39;03;. Riddle et al, 97.). Depois de 2-3 dias de cultura, as células começam a aparecer na borda do explante mostrando uma propensão a deixar o tecido em uma direção radial. Imagens ao vivo permitiu a observação de padrões migratórios sem a necessidade de rotulagem ou marcação das células. Quando expostas a frações da proteína extrato obtido de córtex ferret isocrônico, as células GE apresentado comportamentos diferentes, a julgar pela análise cinética quantitativa de células individuais em movimento.

Imagem lapso de tempo de cultura de tecidos 3D permite estudar o comportamento migratório de células individuais provenientes de eminência ganglionar em reação ao extrato de proteínas fracionadas do córtex cerebral.

Comportamento migratório de células geradas em culturas Eminence ganglionares

A migração de células é um processo comum que leva ao desenvolvimento e à maturação do sistema nervoso central dos vertebrados (Hatten, '99). O cerebral ...

Neste procedimento, um cultivo in vitro é estabelecido para estudar como a migração celular da eminência ganglionar para a córtex cerebral é afetada por diferentes frações do extrato proteico cortical. Primeiro, microesferas de látex são incubadas com frações individuais para preparar fontes de proteínas liberadas lentamente. Um cérebro de furão é dissecado e seccionado coronalmente em fatias espessas.Fragmentos de tecido são retirados das eminências ganglionares. Culturas tridimensionais são montadas contendo os microesferas e os fragmentos embutidos na matriz extracelular. Após um período de incubação, é realizada a aquisição de imagens com intervalo de tempo em microscópio de campo claro.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de uma câmara quimiotática, é que os movimentos de células individuais podem ser observados e quantificados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de desenvolvimento do sistema nervoso, tais como controle quimiotático e de motilidade cinética.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é difícil manipular os pequenos explantes de tecido com o matrigel. Para começar, descongele gradualmente o matrigel congelado em gelo úmido para garantir que a temperatura permaneça baixa o suficiente para evitar a solidificação prematura da matriz enquanto o matrigel está descongelando. Estérilize por filtração e, em seguida, congele em estado pastoso 500 mililitros de fluido cerebral espinhal artificial ou A CSF colocando um frasco de plástico no congelador a menos 80.Quando uma fina camada de gelo se forma nas paredes, quebre-a agitando o frasco e, em seguida, permita a formação de outra camada de isoforma, repetindo o processo até que uma boa suspensão seja criada. Em seguida, prepare o meio neurobasal de acordo com as instruções do fabricante e esterilize por filtração. Use uma membrana de filtro de 0,22 micrômetros, incube a 37 graus Celsius até o momento do uso para absorver a fração proteica nas microesferas ou perlas de látex fluorescentes. Para a difusão no Matrigel, adicione 10 microlitros das perlas a tubos EOR contendo separadamente 100 a 200 microlitros de cada uma das cinco frações proteicas diferentes.Incube no escuro durante 30 minutos à temperatura ambiente em um agitador. Após a incubação de 30 minutos, centrifugue as beterrabas em uma centrífuga de bancada na velocidade máxima durante uma hora. Após anestesiar profundamente o animal com uol, dissecar todo o cérebro e submergi-lo no A CSF previamente preparado e gelado.Sequencie completamente os hemisférios usando um bisturi e corte a corona a 500 micrômetros. Usando um cortador de tecidos ou dispositivo semelhante, colete os cortes em um pequeno recipiente de Petri contendo A CSF gelado e colocado sobre gelo úmido. Usando um microscópio de dissecação, identifique cortes contendo as eminências ganglionares ou ge, e remova regiões do córtex que possam interferir nas etapas subsequentes.Pressione uma perfuradora Harris de diâmetro único na região próxima à superfície ventricular do GE. Retire um fragmento contendo predominantemente a zona ventricular e expulse-o com um êmbolo sobre gelo. Meio neurobasal frio. Transfira um lote de implantes do meio para uma gota de 0,5 mililitro de gel de matrigel gelada colocada em uma placa separada.Certifique-se de que o explante esteja completamente imerso e evite bolhas. Mantenha a placa sobre gelo úmido, trabalhando em uma cabine de cultura de tecidos. Prepare o cultivo.Classifique as placas de poços de seis poços aplicando no centro de cada poço dois microlitros de gel de matri gel frio. Utilizando uma ponteira de pipeta de 20 microlitros e colocando um lamínula de vidro redonda de 18 milímetros autoclavada sobre cada gota. Remova o sobrenadante e re-suspenda as esferas em 10 microlitros de meio neuro basal utilizando um vórtex ou adicione 30 microlitros do gel de matri gel descongelado em gelo à suspensão.Misture bem e coloque no gelo. Com o auxílio do microscópio estereoscópico, coloque um a dois microlitros da suspensão de microesferas utilizando uma pipeta de 20 microlitros e deixe repousar por um a dois minutos, tomando cuidado para não deixar secar. Pegue dois x explan da gota de gel de matriz e coloque-os na região desejada próxima ao depósito de microesferas.Meio milímetro a um milímetro de distância, simetricamente e em lados opostos. Deixe por não mais de cinco minutos à temperatura ambiente. Cubra as esferas nos X berinjelas com uma camada plana de cerca de 30 microlitros de matrigel e coloque em um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por 15 minutos; após a incubação, adicione dois mililitros de meio neurobasal e, em seguida, devolva ao incubador por três a quatro dias.Após a incubação, monitore diariamente a atividade migratória e selecione lamínulas de interesse com implantes que tenham gerado uma nuvem radialmente uniforme de células. Coloque as lamínulas selecionadas em uma placa de cultura fresca e incube durante a noite. Antes da aquisição de imagens, use uma espátula estéril em uma cabine de segurança biológica para movimentar a lamínula e liberar quaisquer microbolhas presentes sob ela.Encha o espaço entre as poças com água para evitar secagem e transfira cuidadosamente a placa para o microscópio. Utilizando um software de imagem, defina um esquema de aquisição, certificando-se de considerar a natureza tridimensional do cultivo mediante a coleta de uma série de planos z.Uma vez definidos os parâmetros, inicie o registro em intervalos de tempo. Aqui é apresentado um registro representativo em lapso de tempo de um gânglio, com a eminência explanada gerando células migratórias. As células migram radialmente para fora do tecido.Sua atração pela fonte proteica é variável, dependendo da natureza da fonte. Neste filme com maior aumento, é possível rastrear facilmente células individuais em movimento. Conforme indicado pelas setas, muitas células são vistas em ramificação.Alguns desses são indicados com setas. O rastreamento de células individuais fornece informações posicionais que podem ser analisadas posteriormente. Gráficos de exemplo mostram uma resposta diferencial entre as frações A e D, evidenciada por trajetórias distintas de células que deixam a explanta. Uma vez dominado.Essa técnica pode ser realizada em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter o gel da matriz em gelo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar uma fonte de liberação lenta de proteínas, montar um cultivo celular tridimensional e realizar imagens com lapso de tempo para observar e analisar os movimentos de células individuais.

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Neuroscience

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