Modificado anexina V / propídio Assay Apoptose Iodeto para avaliação rigorosa da morte celular

O objetivo geral do experimento é superar os problemas atuais com as técnicas convencionais de coloração de anexina cinco e iodeto de propídio para avaliação da morte celular por apoptose e/ou necrose. Descobrimos que as abordagens convencionais de coloração de uma ampla gama de linhagens celulares e células primárias resultam em até 40% de eventos falsos positivos. Esses eventos falsos positivos são devidos à coloração do RNA citoplasmático.

Por outro lado, nosso protocolo reduz drasticamente o número de incidências de falsos positivos, introduzindo etapas de fixação e degradação de RNA em estágios específicos No procedimento de coloração, as primeiras células são coradas com um X em cinco e iodeto de perídio para detectar a morte celular de acordo com os procedimentos convencionais. Em seguida, as células são fixadas com 1% de formaldeído, o que aumenta a permeabilidade da membrana plasmática. Finalmente, as células fixadas são tratadas com RNAs A para degradar o RNA citoplasmático, eliminando o falso positivo causando coloração com iodeto de propídio.

Como muitos biólogos celulares, usamos métodos convencionais de citometria de fluxo de nexina cinco e iodeto de propídio para detectar a morte celular apoptótica e necrótica. Infelizmente, descobrimos recentemente que esse método leva a um número significativo de eventos falsos positivos de até 40% em uma variedade de linhagens celulares e células primárias. Este método atualizado supera essas ressalvas.

Nossa abordagem aproveita a fixação celular e a digestão do RNA em etapas específicas ao longo do procedimento para remover seletivamente o RNA plasmático cyop, coloração que leva diretamente a esses eventos falsos positivos, colhendo as células a serem analisadas para o experimento. Neste vídeo, usamos macrófagos brutos. Como exemplo, centrifugue as amostras a 335 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius, decanta o sobrenadante e ressuspende as células em dois mililitros de um XPBS.

Em seguida, lave as células novamente nas mesmas condições. Desta vez, resus suspendendo as células em um mililitro de um X NX e cinco tampão de ligação. Depois de centrifugar as amostras e decantar o sobrenadante novamente, ressuspenda as células em um volume final de 100 microlitros do tampão de ligação de um X NX Xin cinco.

Adicione um Xin cinco a cada amostra de célula de acordo com as recomendações do fabricante. Por exemplo, neste vídeo, 2,5 microlitros de um Xin five zi estão sendo adicionados a cada tubo inferior redondo de poliestireno. Incube os tubos no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 100 microlitros de um X NX em cinco tampão de ligação a cada tubo de reação. Agora deve haver aproximadamente 200 microlitros de solução em cada tubo. Em seguida, prepare uma diluição de um a 10 de propídio, iodeto ou PI em um tampão de ligação X NX.In cinco, adicione quatro microlitros do PI diluído a cada tubo, produzindo uma concentração final de dois microgramas por mililitro pi em cada amostra.

Incube os tubos no escuro novamente por 15 minutos em temperatura ambiente. Após este período de incubação, lave as células com 500 microlitros de um tampão de ligação x e x e cinco e centrifugue as amostras a 335 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius e decantar o snat. Ressuspenda as células em mais 500 microlitros de um X NX e cinco tampão de ligação com 500 microlitros de 2% de formaldeído.

Para criar uma solução de formaldeído a 1%, misture os tubos com movimentos suaves. Fixe as amostras no gelo por 10 minutos após a fixação. Adicione um mililitro de um XPBS a cada amostra e misture delicadamente, agitando as células a 425 Gs por oito minutos a quatro graus Celsius três vezes durante a lavagem.

Prepare uma diluição de um a 100 de RNA A em um XPBS, ressuspenda o pellet sacudindo os tubos e adicione 16 microlitros de RNAs diluídos, uma solução para dar uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Em seguida, incube as amostras por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as células em um mililitro de um XPBS e misture delicadamente sacudindo e centrifugue os tubos a 425 GS por oito minutos a quatro graus Celsius.

As amostras agora estão prontas para serem analisadas. Alternativamente, as amostras podem ser usadas para etapas de coloração subsequentes se a coloração N-X-M-P-I estiver sendo realizada em paralelo com outros procedimentos. Imagens representativas do citômetro de fluxo de fluxo de imagens mostram a extensão da coloração falso-positiva em três populações de células únicas.

Uma linha celular comumente usada, macrófagos brutos, e duas linhas celulares primárias espelhando macrófagos da medula óssea e macrófagos renais primários de peixinho dourado. O uso de macrófagos primários de peixes dourados destaca a aplicabilidade dessa técnica em uma variedade de plataformas celulares. Eventos verdadeiros positivos exibem a colocalização esperada dentro do compartimento nuclear entre PI e drac.

Cinco, um corante altamente permeável à membrana que mancha com precisão o compartimento nuclear de células vivas e mortas, como evidenciado pela coloração amarela. Aqui, a precisão da coloração nuclear PI foi avaliada com base em seu grau de semelhança com D dr cinco, BRDU sete AA D DPI e DRAC cinco exibiu mais de 99% de similaridade em sua capacidade de corar com precisão o núcleo na linha celular bruta de macrófagos 2 64 0,7. Por outro lado, a coloração citoplasmática de PI que ocorre ao usar protocolos convencionais levou a uma diminuição acentuada na porcentagem de similaridade da coloração nuclear em relação ao d dr cinco.

Nesta figura, pode-se ver que a incorporação de 50 microgramas por mililitro de RNAs A remove a coloração PI não nuclear e aumenta significativamente o grau de similaridade em relação à coloração d dr five em células de macrófagos renais primários murn, macrófagos da medula óssea e peixinhos dourados. Imagens representativas de macrófagos renais primários nesta figura mostram a perda de coloração de RNA no compartimento citoplasmático com o tratamento com RN a. Esses gráficos de dispersão de macrófagos renais primários de peixinhos dourados mostram uma redução significativa de eventos necróticos apoptóticos falsos em células preparadas com o protocolo PI de nexina modificado.

O novo protocolo mostra que 84,9% das células são viáveis. As portas foram desenhadas com base em amostras de fluxo de imagens paralelas que avaliam características fluorescentes e morfológicas. Em um exemplo, monócitos progenitores precoces e macrófagos maduros foram corados pelo protocolo NX modificado em cinco PI descrito neste vídeo, ou pelo método convencional para esta figura celular corada pelo protocolo modificado exibiu uma redução visual no número de eventos PI positivos devido à remoção de eventos falsos positivos pelo tratamento com RNAs.

Além disso, esse efeito foi mais pronunciado em grandes células maduras de macrófagos do que em células progenitoras menores e precoces. Conclusões baseadas em protocolos convencionais teriam sugerido erroneamente uma correlação positiva na morte celular para os subconjuntos de macrófagos mais maduros Após este procedimento de coloração, outras etapas, como coloração intracelular ou de superfície, podem ser realizadas para responder a perguntas específicas sobre as subpopulações dentro de seu isolado de células. A relevância desta técnica vai além de questões baseadas em imunidade, por exemplo, também é relevante para sistemas experimentais que utilizam células submetidas a estresse genotóxico, células tratadas com parada do ciclo celular, drogas como timidina ou hidroxiureia e estudos em células embrionárias onde a progressão do desenvolvimento é caracterizada por mudanças discretas na síntese de RNA celular.