Name: Modificado anexina V / propídio Assay Apoptose Iodeto para avaliação rigorosa da morte celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda um protocolo modificado de anexina V/iodeto de propídio para avaliar morte celular com maior precisão. Este método reduz falsos positivos através de fixação e degradação de RNA.

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Este estudo foi apoiado por um Conselho Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e uma bolsa de pesquisa Alberta Agricultura Financiamento Consórcio conceder a DRB. AMR é suportado através de um canadense Vanier de Bolsas de Pós-Graduação NSERC, da Universidade de Alberta estágio de ensino e uma rainha Elizabeth II bolsa de pós-graduação.

Este procedimento pode ser realizado em 500 mL mangueiras siliconizadas ou 6 mL de poliestireno tubos de fundo redondo de FACS. O último é normalmente utilizado na realização de análise de viabilidade em conjunto com outros procedimentos. Todos os volumes indicados são para 6 mL de poliestireno tubos de fundo redondo de FACS. Para 500 mL mangueiras siliconizadas, de reduzir todos os volumes por 05/01. A concentração ótima para a análise de citometria de fluxo é de 2-4 x 10 6 células por volume de 200 mL. Perda de células pode resultar desse procedimento e, portanto, recomendamos que cada amostra composta de 4 x 10 6 células no início do procedimento. 1. Preparação de células <ol><li> Células colheita - referem-se a procedimentos específicos para linhagens de células correspondente ou isolamentos de células primárias. </li><li> Centrifugar as amostras a 335 x g por 10 minutos e decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 2 mL de fosfato x 1 solução salina tamponada (PBS) - / - (sem cálcio, magnésio não). </li><li> Centrifugar as amostras a 335 x g por 10 minutos e decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 1 mL 1 x anexina V buffer de ligação. </li><li> Centrifugar as amostras a 335 x g por 10 minutos e decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 100 mL 1 x anexina V buffer de ligação. </li></ol> 2. Aplicação de anexina V / PI Stain <ol><li> Adicionar anexina V de acordo com as recomendações do fabricante [por exemplo, 5 mL anexina V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. </li><li> Incubar os tubos no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 100 mL de tampão 1 x V anexina ligação a cada tubo de reacção. Deve haver cerca de 200 mL em cada tubo. </li><li> Adicionar 4 mL de PI (Sigma, Cat # P-4864-10ML) que foi diluída 1:10 em tampão 1 x V anexina vinculativo (isto é, PI 1 mL com 9 x 1 mL de buffer V anexina ligação). O resultado será uma concentração final de 2 PI mcg / mL em cada amostra. </li><li> Incubar os tubos no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 500 mL 1 x anexina V tampão de ligação para lavar as células. </li><li> Centrifugar as amostras a 335 x g por 10 minutos e decantar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 500 mL de buffer 1 x aderência à anexina V e 500 mL de formaldeído a 2% para criar uma solução a 1% de formaldeído (fixador). Mix tubos sacudindo gentil. </li><li> Fix amostras no gelo por 10 minutos. Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C no escuro. Se o último método é escolhido, certifique-se de ser coerente em todos os tubos rotulados com anexina V / PI (incluindo controles de compensação). </li><li> Adicionar 1 mL 1 x PBS - / - para cada amostra e misturar delicadamente por flicking. </li><li> Centrifugar os tubos a 425 x g por oito minutos e decantar o sobrenadante. </li><li> Repita os passos 2.10 e 2.11. </li><li> Ressuspender pellet sacudindo o tubo. </li><li> Adicionar 16 mL de 1:100 diluídos RNase A (Sigma, R4642) para dar uma concentração final de 50 mcg / mL. Incubar por 15 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 1 mL 1 x PBS - / - e misture delicadamente sacudindo. </li><li> Centrifugar os tubos a 425 x g por oito minutos. </li><li> Amostras está agora pronto para ser analisado. Alternativamente, as amostras podem ser utilizados para as etapas subseqüentes coloração se anexina / PI coloração está sendo realizada em paralelo com outros procedimentos. </li></ol> 3. Resultados representativos: Exemplos de tipos de células e linhas de células que têm diferentes graus de falso-positivo coloração PI são mostrados na Figura 1. Para explicar os eventos falso-positivos, as células foram fixadas e então tratadas com RNase A. Isto resulta em uma diminuição significativa no número de falso-positivo de eventos, em comparação com as células que não foram submetidos a tratamento RNase (Figura 2B). Figura 2C mostra imagens representativas das células que foram submetidos a RNase tratamento, em comparação com as células que não tinha tratamento RNase. A Figura 3 mostra como a modificação anexina V / PI protocolo, com fixação e etapas de tratamento RNase, melhora a protocolos convencionais, limitando o número de eventos de falso-positivo coloração. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Convencionais propidium protocolos de coloração iodeto de levar a um número significativo de falsos acontecimentos positivos. Temos previamente avaliados extensão da coloração falso positivo em células primárias em uma ampla gama de modelos animais, bem como em uma variedade de linhas de células 10. Imagens representativas mostram extensão da coloração falso positivo em três populações de células únicas (uma linhagem de células comumente usados ​​- macrófagos RAW e duas pilhas - macrófagos da medula óssea de camundongos (BMM) e macrófagos goldfish primário renal (PKM)). Verdadeiros acontecimentos positivos exibir o esperado co-localização entre PI e DRAQ5 no interior do compartimento nuclear (áreas amarelas representam co-localização entre PI e DRAQ5). DRAQ5 é altamente membrane permeável corante que precisa compartimento manchas nuclear em ambas as células vivas e mortas 10,11,12. Para facilitar a determinação visual da co-localização DRAQ5 mancha foi dado um pseudocolour verde. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Melhorar a precisão do PI coloração nuclear. (A) Avaliamos a precisão de PI coloração nuclear com base no grau de semelhança de uma série de bem caracterizados manchas nuclear (BrdU, 7-AAD e DAPI) para DRAQ5. BrdU é um nucleosídeo sintético que é incorporada ao DNA de células em proliferação, e como tal só mancha no interior do compartimento nuclear. 7-AAD tem uma alta afinidade por DNA e, semelhante ao PI, não pode atravessar uma membrana plasmática intacta. DAPI também tem uma forte afinidade por DNA e é o mais comumente usado nuclear mancha em microscopia fluorescente. O grau de similaridade foi&gt; 99% entre BrdU, 7-AAD, DAPI e DRAQ5, destacando a sua capacidade de precisão mancha do núcleo da célula em RAW 264,7 macrófagos. Em contraste, coloração citoplasmática PI baseado em protocolos convencionais leva a uma diminuição acentuada na similaridade de coloração por cento em relação ao DRAQ5. (B) Resultados semelhantes foram observados em duas pilhas testadas: os macrófagos da medula óssea de camundongos (BMM) e macrófagos goldfish primário renal (PKM). Incorporação de 50 mg / mL de RNase A na fase específica dentro do processo de coloração não remove a coloração nuclear PI e aumenta significativamente o grau de semelhança em relação ao DRAQ5 coloração. (C) Imagens representativas de macrófagos primárias de rim de mostrar o grau de semelhança para as células com e sem tratamento RNase. Para facilitar a determinação visual das diferenças entre os tratamentos, DRAQ5 foi dado um verde. Áreas amarelas representam co-localização entre BrdU e DRAQ5 e PI e DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Modificado anexina V / PI reduz significativamente a apoptose false / eventos necrótico. Macrófagos goldfish primário renal (PKM) foram coradas com convencional e modificado anexina V / PI protocolos. Gráficos de dispersão retratam a anexina V / PI mancha em PKM goldfish. A dispersão da esquerda mostra convencionais anexina V coloração / PI (sem RNase) de células PKM. A dispersão da direita mostra células PKM manchadas com o anexina V modificado / protocolo IP (com RNase). A adição dos resultados da RNase em uma acentuada redução do PI coloração devido à remoção de manchas falsos positivos. PKM células foram então analisados ​​com base em populações distintas dentro da progenitores culturas precoce (EP), monócitos (Mono) e macrófagos maduros (Mat mac). A redução do número de eventos PI positivo, devido à remoção de falsos eventos positivos é mais pronunciado em grandes macrófagos maduros do que em menor células progenitoras cedo. Conclusões baseadas em protocolos convencionais teria erroneamente sugere uma correlação positiva na morte celular para subconjuntos de macrófagos mais maduro.

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<li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li>
<li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A anexina V / PI protocolo aqui apresentado é uma versão modificada de protocolos convencionais e leva em conta a presença de RNA no citoplasma que também tem alta afinidade para o PI. Introdução de RNase A (50 mg / mL), após um passo de 1% de formaldeído de fixação no final do processo de coloração melhora significativamente a precisão da coloração PI nuclear. Sem efeitos negativos são observados na coloração PI nuclear ou membrana plasmática anexina V coloração. Sem tratamento RNase A, até 40% dos resultados PI mancha pode levar a falsos eventos positivos, o que leva a um impacto potencialmente significativo e negativo sobre as conclusões a jusante 10. Nosso modificada anexina V protocolo de coloração / PI é simples e tem sido utilizada de forma eficaz em uma ampla gama de tipos de células (células primário: os macrófagos da medula óssea de camundongos e esplenócitos, células residentes suína pulmão, macrófagos alveolares do pulmão, os isolados do nó de linfa mesentérica, leucócitos do sangue periférico , esplenócitos, células blastoderma frango; macrófagos goldfish primárias de rim; leucócitos do sangue periférico de carpa; linhas Cell: RAW 264,7 macrófagos, células Jurkat T, suína 3D4/31 macrófagos, CCL-71 fibroblastos fin goldfish, peixe-gato 3B11 células B 10). É importante notar que as células são diferencialmente afetados pela coloração PI falso positivo, com pilhas geralmente tendo um maior número de falsos eventos positivos 10. As diferenças de coloração PI falso positivo entre essas populações celulares pode ser parcialmente atribuída a diferenças no tamanho das células, mas também podem resultar de diferenças no conteúdo de RNA. Como a incorporação, tais deste procedimento é particularmente relevante para sistemas experimentais que utilizam, entre outras, células submetidos a estresse genotóxico, as células tratadas com drogas parada do ciclo celular, tais como timidina ou hidroxiuréia, as células infectadas por vírus, e estudos sobre células embrionárias, onde a progressão do desenvolvimento é caracterizado por mudanças discretas na síntese de RNA celular.

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x Tampão de Ligação de Anexina V</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL em H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formaldeído 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>RNase A de pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td>Diluir 1:60 em 1 x PBS-/-</td></tr></tbody></table>

modificado anexina v / propídio assay apoptose iodeto para avaliação rigorosa da morte celular

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Estudos da apoptose celular foram afetados significativamente desde a introdução da citometria de fluxo baseado em métodos. Iodeto de propídio (PI) é amplamente usado em conjunto com anexina V para determinar se as células são viáveis, apoptóticas ou necróticas através de diferenças na integridade da membrana plasmática e 1,2 permeabilidade. A anexina V / PI protocolo é um método comumente usado para estudar as células apoptóticas 3. PI é utilizado mais frequentemente do que outras manchas nuclear porque é econômico, estável e um bom indicador de viabilidade celular, com base em sua capacidade de excluir corante em células vivas 4,5. A capacidade de PI para inserir uma célula é dependente da permeabilidade da membrana; PI não mancha ao vivo ou no início de células apoptóticas devido à presença de uma membrana plasmática intacta 1,2,6. No final de células apoptóticas e necróticas, a integridade das membranas plasmática e nuclear diminui 7,8, permitindo PI para passar através das membranas, intercalam em ácidos nucléicos, e apresentar fluorescência vermelha 1,2,9. Infelizmente, descobrimos que convencionais anexina V / PI protocolos levar a um número significativo de falsos eventos positivos (até 40%), que estão associados a PI de coloração de RNA no compartimento citoplasmático 10. Pilhas e linhas celulares em uma ampla gama de modelos animais são afetados, com células grandes (nuclear: relações citoplasmática &lt;0,5), mostrando a maior ocorrência 10. Aqui, nós demonstramos um método modificado anexina V / PI que proporciona uma melhoria significativa para a avaliação da morte celular em comparação com métodos convencionais. Este protocolo tira proveito das mudanças na permeabilidade celular durante célula de fixação para promover a entrada de RNase A para as células seguintes coloração. Tanto tempo e concentração de RNase A foram otimizados para a remoção de RNA citoplasmático. O resultado é uma melhoria significativa em relação convencional anexina V / PI protocolos (&lt;5% eventos com coloração citoplasmática PI).

Um método preciso para a avaliação da morte celular é descrito. O protocolo convencional melhora a anexina V / iodeto de propídio (PI) protocolos, que apresentam até 40% de falsos-positivos eventos em linhagens celulares e pilhas de uma ampla gama de modelos animais.

Modificado anexina V / propídio Assay Apoptose Iodeto para avaliação rigorosa da morte celular

Estudos de apoptose celular foram significativamente impactados desde a introdução de métodos baseados em citometria de fluxo. O iodeto de propídio (PI) é amplamente...

O objetivo geral do experimento é superar os problemas atuais com as técnicas convencionais de coloração com Anexina cinco e iodeto de propídio para avaliação da morte celular por apoptose e/ou necrose. Descobrimos que abordagens convencionais de coloração em uma ampla gama de linhagens celulares e células primárias resultam em até 40% de eventos falsos positivos. Esses eventos falsos positivos são decorrentes da coloração do RNA citoplasmático.Por outro lado, nosso protocolo reduz drasticamente o número de ocorrências de falsos positivos ao introduzir etapas de fixação e degradação de RNA em estágios específicos do procedimento de coloração. Primeiramente, as células são coradas com X em cinco e iodeto de peridina para detectar a morte celular conforme procedimentos convencionais. Em seguida, as células são fixadas com formaldeído 1%, o que aumenta a permeabilidade da membrana plasmática. Por fim, as células fixadas são tratadas com RNase A, a fim de degradar o RNA citoplasmático, eliminando a coloração por iodeto de propídio que causa falsos positivos.Como muitos biólogos celulares, utilizamos métodos convencionais de citometria de fluxo com nexina V e iodeto de propídio para detectar morte celular apoptótica e necrótica. Infelizmente, descobrimos recentemente que este método gera um número significativo de eventos falsos positivos, chegando a 40%, em uma variedade de linhagens celulares e células primárias. Este método atualizado supera essas limitações.Nossa abordagem aproveita a fixação celular e a digestão do RNA em etapas específicas ao longo do procedimento para remover seletivamente o RNA citoplasmático, corante que diretamente leva a esses eventos falsos positivos. Colete as células a serem analisadas para o experimento. Neste vídeo, utilizamos macrófagos brutos como exemplo. Centrifugue as amostras a 335 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius, decante o sobrenadante e re-suspenda as células em dois mililitros de PBS 1X.Em seguida, lave as células novamente nas mesmas condições. Desta vez, reconstitua a suspensão das células em um mililitro de tampão de ligação NX 1X e cinco. Após a centrifugação das amostras e a remoção do sobrenadante, novamente reconstitua a suspensão das células em um volume final de 100 microlitros do tampão de ligação NX Xin 1X e cinco.Adicione Xin cinco a cada amostra celular de acordo com as recomendações do fabricante. Por exemplo, neste vídeo, 2,5 µL de Xin cinco zi estão sendo adicionados a cada tubo de fundo redondo de poliestireno. Incube os tubos no escuro por 15 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 100 microlitros de um X NX em cinco tampão de ligação a cada tubo de reação. Agora deve haver aproximadamente 200 microlitros de solução em cada tubo. A seguir, prepare uma diluição de um para 10 de iodeto de propídio ou PI em um X NX em cinco tampão de ligação, adicione quatro microlitros do PI diluído a cada tubo, obtendo uma concentração final de dois microgramas por mililitro de PI em cada amostra.Incube os tubos no escuro novamente por 15 minutos à temperatura ambiente. Após este período de incubação, lave as células com 500 microlitros de tampão de ligação 1x e x e cinco e centrifugue as amostras a 335 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante. Re-suspenda as células em outros 500 microlitros de tampão de ligação 1X NX e cinco com 500 microlitros de formaldeído 2%.Para preparar uma solução de formaldeído a 1%, misture os tubos com leves movimentos de flicking. Incube as amostras em gelo por 10 minutos após a fixação. Adicione um mililitro de PBS 1X a cada amostra e misture suavemente com movimentos de flicking; centrifugue as células a 425 Gs por oito minutos a quatro graus Celsius, repetindo o processo de lavagem três vezes.Prepare uma diluição de um para 100 do RNA A em um XPBS, ressuspenda o pellet agitando suavemente os tubos e adicione 16 microlitros da solução diluída de RNA A para obter uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Em seguida, incube as amostras por 15 minutos a 37 graus Celsius. Depois, lave as células com um mililitro de um XPBS e misture suavemente agitando, então centrifugue os tubos a 425 ×g por oito minutos a quatro graus Celsius.As amostras estão agora prontas para serem analisadas. Alternativamente, as amostras podem ser usadas em etapas subsequentes de coloração, caso a coloração N-X-M-P-I esteja sendo realizada em paralelo com outros procedimentos. Imagens representativas de citômetro de fluxo por corrente de imagem mostram o grau de coloração falso-positiva em três populações celulares distintas.Uma linhagem celular comumente utilizada é a de macrófagos brutos, além de duas linhagens celulares primárias que imitam macrófagos da medula óssea e macrófagos primários do rim de peixe-dourado. O uso de macrófagos primários de peixe-dourado destaca a aplicabilidade desta técnica em diversas plataformas celulares. Eventos verdadeiramente positivos exibem a colocalização esperada dentro do compartimento nuclear entre PI e drac.Cinco, um corante altamente permeável à membrana que cora com precisão o compartimento nuclear de células vivas e mortas, conforme evidenciado pela coloração amarela. Aqui, a precisão da coloração nuclear com PI foi avaliada com base em seu grau de semelhança com D dr cinco BRDU sete A.A D DPI, e DRAC cinco exibiu mais de 99% de semelhança em sua capacidade de corar com precisão o núcleo na linhagem celular de macrófagos RAW 264.7. Em contraste, a coloração citoplasmática com PI que ocorre ao utilizar protocolos convencionais levou a uma diminuição acentuada na porcentagem de semelhança da coloração nuclear em relação ao d dr cinco.Nesta figura, pode-se observar que a incorporação de 50 microgramas por mililitro de RNAs A remove a coloração com PI não nuclear e aumenta significativamente o grau de semelhança em relação à coloração com d dr cinco em células de macrófagos da medula óssea murina, medula óssea e macrófagos primários do rim de peixe-dourado. As imagens representativas de macrófagos primários do rim nesta figura mostram a perda da coloração de RNA no compartimento citoplasmático com o tratamento com RNAs. Esses gráficos de dispersão de macrófagos primários do rim de peixe-dourado mostram uma redução significativa de eventos falsos de apoptose e necrose em células preparadas com o protocolo modificado de nexina e PI.O novo protocolo mostra que 84,9% das células são viáveis. As janelas foram definidas com base em amostras paralelas de fluxo de imagens que avaliam características fluorescentes e morfológicas. Em um exemplo, progenitores precoces, monócitos e macrófagos maduros foram corados pelo NX modificado no protocolo PI cinco descrito neste vídeo, ou pelo método convencional; para esta figura, a célula corada pelo protocolo modificado exibiu uma redução visual no número de eventos PI positivos devido à remoção de eventos falsos positivos pelo tratamento com RNAses.Além disso, esse efeito foi mais acentuado em células de macrófagos grandes e maduras do que em células menores e precursoras. Conclusões baseadas em protocolos convencionais teriam sugerido erroneamente uma correlação positiva na morte celular para os subconjuntos mais maduros de macrófagos. Após este procedimento de coloração, etapas adicionais, como coloração intracelular ou de superfície, podem ser realizadas para responder perguntas específicas sobre as subpopulações dentro do seu isolado celular. A relevância desta técnica vai além de questões baseadas na imunidade; por exemplo, também é relevante para sistemas experimentais que utilizam células submetidas a estresse genotóxico, células tratadas com interrupção do ciclo celular, drogas como timidina ou hidroxiuréia, e estudos em células embrionárias onde a progressão do desenvolvimento é caracterizada por mudanças discretas na síntese de RNA celular.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de ligação da Anexina V para medir o grau de eriptose, morte celular programada por eritrócitos, usando coloração fluorescente com Anexina V. Os eritrócitos apoptóticos demonstram translocação de fosfatidilserina do folheto interno para o externo da membrana celular, fazendo com que a Anexina V marcada com fluoróforo se ligue à fosfatidilserina translocada, emitindo assim um sinal fluorescente.

Ensaio de ligação de anexina V: uma técnica baseada em fluorescência para identificar eritrócitos apoptóticos por meio da marcação de fosfatidilserina

Os compostos terapêuticos são muitas vezes primeiro analisou in vitro com ensaios de viabilidade. Contagem de células cegos por um observador humano pode ser altamente sensível a pequenas alterações no número de células, mas não avaliar a função. Ensaios de viabilidade computadorizados, como descrito aqui, pode avaliar a estrutura e função de uma forma objectiva.

Ensaios de viabilidade para células em cultura

Ensaios Multiplex pode fornecer informações úteis para os mecanismos celulares básicos e eliminar o desperdício de reagentes e experiências repetitivas desnecessárias. Descrevemos aqui um ensaio multiplex atividade caspase-3/7, usando métodos fluorescentes e luminescentes à base, para determinar a viabilidade celular em um modelo in vitro hipotálamo seguinte desafio oxidativo com ácido palmítico.

Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Um fluxo de trabalho usando a centrifugação diferencial ou citometria de fluxo é desenvolvido para detectar, quantificar e isolar corpos apoptotic de uma amostra de apoptotic de alta pureza.

Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza

O protocolo descreve um ensaio rápido, de alto rendimento, confiável, barato e imparcial para determinar eficientemente a viabilidade celular. Este ensaio é particularmente útil quando as mitocôndrias das células foram danificadas, o que interfere com outros ensaios. O ensaio utiliza a contagem automatizada de células manchadas com dois corantes nucleares – Hoechst 33342 e iodeto de propidium.

Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana

A apoptose pode ser caracterizada pela análise por citometria de fluxo de biomarcadores apoptóticos precoce e tardio. A linhagem celular de câncer cervical, SiHa, foi analisada para biomarcadores de apoptose após tratamento com Actinomicina D usando citômetro de fluxo de bancada.

Análise por citometria de fluxo de biomarcadores apoptóticos em células de câncer cervical SiHa tratadas com Actinomicina D

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

Pyrosequencing (R) é um dos métodos mais completo e simples até à data utilizada para analisar polimorfismos. Este método levou a uma avaliação rápida e eficiente polimorfismo de nucleotídeo único incluindo muitos polimorfismos clinicamente relevantes. A técnica e metodologia de Pyrosequencing é explicado.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Aprenda um protocolo modificado de anexina V/iodeto de propídio para avaliar morte celular com maior precisão. Este método reduz falsos positivos através de fixação e degradação de RNA.

Modificado anexina V / propídio Assay Apoptose Iodeto para avaliação rigorosa da morte celular

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