Name: Imagem bioluminescência para avaliação das respostas imune após o implante do tecido do coração Engineered (EHT) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a usar imagem de bioluminescência in vivo para avaliar respostas imunes após implante de tecido cardíaco bioengenheiro em ratos. Este método permite monitoramento longitudinal não invasivo da sobrevivência do enxerto.

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Sonja Schrepfer, Lenard Conradi e Arne Hansen recebeu financiamento da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1). O trabalho também foi suportado por concessões da União Européia para Thomas Eschenhagen (EUGeneHeart e Angioscaff).

1. EHT Geração e Cultura Condições Fabricação de fibrina baseado EHT foi realizada conforme já descrito 4. Em resumo, para gerar fibrina baseado EHT para fins de implantação, um master mix foi preparado contendo células isoladas de ROSA neonatal / luciferase-LEW corações de ratos transgênicos, fibrinogênio bovino e Matrigel. Moldes de fundição de agarose foram preparadas utilizando espaçadores Teflon colocado em pratos bem 6-cultura. Após a solidificação da agarose, espaçadores foram retirados e racks pós silicone foram colocados em placas de cultura com posts atingindo os moldes. Para gerar EHT, a Mastermix foi brevemente misturado com um montante calculado de trombina e pipetado no molde. Após a polimerização do fibrinogênio, racks de silicone com EHTs aderir aos postos foram delicadamente retirados dos moldes de fundição agarose, transferidos para novas 6-bem os pratos de cultura de células e mantidas em 37 ° C, 7% CO 2 de cultura de células incubadora usando custom-made meio de cultura celular. EHT foram mantidos em condições de cultura de células até o dia dez. Durante este período, as células do coração de ratos neonatal começou a interligar, de forma alongada e alinham ao longo linhas de força entre posts silicone. No momento da implantação, as contrações espontâneas coerente foram observados, desviando posts silicone. 2. Implantação EHT EHT implantação foi realizado em ambos os imunocompetentes Brown Norway (BN) ratos ou ratos imunodeficientes nua para investigar a resposta imunológica alogênica. BN e nu ratos pesando 100-150 g foram adquiridos da Charles River Alemanha (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) e alojados em condições convencionais, alimentados padrão ração e água ad libidum. Ratos imunodeficientes estão alojados em cama estéril, gaiolas, e água esterilizada é utilizada. O comitê de revisão ética alemã analisou e aprovou os procedimentos animal. Todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados antes da utilização. O procedimento de implante são realizadas da seguinte forma: Ratos são anestesiados com isoflurano (2,5-3%) utilizando uma câmara de indução. A exposição humana à isoflurano pode ser reduzida através do trabalho em uma tabela downdraft ou capuz não recirculação. Temperatura corporal é mantida durante o procedimento cirúrgico. <ol><li> Shave área abdominal e aplicar pomada para evitar os olhos de secar durante a anestesia. </li><li> Coloque o rato sobre as suas costas e colocar uma máscara sobre seu nariz e boca para manter a anestesia. </li><li> Desinfetar a área abdominal com Betadine e, em seguida, o etanol 80%. Cotonete limpo para sujo, do centro da área raspada se movendo para fora em direção à área de cabelos. </li><li> Verifique reflexos beliscar as patas traseiras para ter a certeza que o rato é suficientemente anestesiados. </li><li> Drape do animal e realizar uma incisão mediana abdominal separando a pele eo músculo em duas etapas para abrir o abdômen. Esterilização talão quente é usado entre a pele e abertura do músculo. </li><li> Coloque o intestino em uma luva de pó aquecido salina hidratada livre. Dobre a luva ao redor do intestino para evitar a perda de umidade. </li><li> Remover tecido adiposo e expor o baço. </li><li> Visualize e se espalhou omento maior com uma pinça. </li><li> Corte cuidadosamente EHT de suspender posts silicone e transferir para o omento maior. </li><li> Enrole a omentus maior em torno da EHT e corrigir usando dois única prolene 7-0 (Ethicon, Norderstedt, Alemanha) </li><li> Em seguida mova o intestino volta para o abdômen. </li><li> Lave o abdome com solução salina estéril pré-aquecido. </li><li> Feche a camada muscular da parede abdominal com prolene 6-0 sutura (Ethicon, Norderstedt, Alemanha). </li><li> Use 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, Alemanha), sutura contínua para fechar a pele. </li><li> Enquanto o rato ainda está em anestesia, injectar 5 carprofeno mg / kg por via subcutânea. </li><li> Para oferecer analgesia suficiente para este tipo de procedimento, um analgésico (como metamizol) é adicionado à água potável (50 mg por 100 ml metamizol) para dor medicação por 3 dias após o transplante. </li></ol> 3. Imagem de bioluminescência de Implantação Após EHT A plataforma bioimaging IVIS (Xenogen, Alameda, CA, EUA) é usado para não-invasivos de imagem de bioluminescência in-vivo e os resultados são analisados ​​utilizando a imagem viva IVIS (Xenogen) pacote de software. Imagem é realizada diariamente a partir 2 horas pós-operatório. Anestesiar ratos com isoflurano (2,5 - 3%), utilizando uma câmara de indução. <ol><li> Desinfectar a zona abdominal e torácica amplamente utilizando Iodo-Provo, use próxima de etanol 80%, repita este passo três vezes. </li><li> Injetar d-luciferina (Xenogen; 375 peso corporal mg / kg) ip </li><li> Lugar ratos anestesiados para a imagem IVIS câmara (até 4 ratos podem ser analisados ​​ao mesmo tempo). </li><li> Avaliar a intensidade do sinal luc + células dentro EHT em unidades de fótons / seg / cm 2 / steridianin a região de interesse (ROI) no início do estudo (120 minutos após o implante) e nos dias 1, 2, 3, 5, 7, 10, e nas semanas 2, 3 e 4. Observe o sinal de pico (aparece cerca de 20 minutos após o d-Luciferina injecção). </li></ol> Criar um gráfico (Excel), mostrando a intensidade do sinal ao longo do tempo. 4. Correlação de Resultados BLI e ELISPOT O celular in vivo respostas imunes em imunocompetentes e imunodeficientes BN ratos nus foram estudados após EHT transplante. O baço dos animais receptores foi colhida 5 dias após o transplante EHT para isolar esplenócitos destinatário. Ensaios de ELISPOT com mitomicina-inibida EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como estimulador e 5 x10 6 esplenócitos destinatário como células de resposta foram realizados de acordo com protocolo do fabricante (BD Biosciences) IFN-γ usando e IL-4 revestido placas para investigar TH1, TH2 e resposta, respectivamente. IFN-γ e IL-4 spots foram significativamente maiores no modelo, imunocompetentes em relação ao modelo imunodeficientes (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; Student t-test). 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Correlação de resultados BLI e ELISPOT a) O celular in vivo respostas imunes em imunocompetentes Brown Noruega e imunodeficientes ratos nus foram estudados após o implante EHT. Esplenócitos destinatário foram colhidas cinco dias após o implante EHT. IFN? e IL-4 expressão foi avaliada por ensaios ELISpot com mitomicina-inibida EHT como estimuladores e 5x106 esplenócitos destinatário como células responder. Th1 e Th2 foram significativamente maiores no modelo imunocompetentes em relação ao modelo imunodeficientes como evidenciado pelo IFNγ e IL-4, respectivamente. b) EHTs Luc + foram transplantadas para o omentus maior de ambos os ratos BN imunocompetentes ou imunodeficientes ratos nude. Sobrevivência celular foi seguido por longitudinalmente BLI. A taxa de animais que rejeitou a EHTs transplantado é apresentado. Todos os ratos BN rapidamente rejeitou a transplantes EHT, enquanto as células sobreviveram em ratos células T deficiente.

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Antes da implementação clínica da tecnologia EHT para reparação cardíaca, questões fundamentais, como a imunogenicidade de ambos os componentes celulares e da matriz ou sobrevida do enxerto após o implante devem ser avaliados em modelos experimentais. In-vivo de imagem de bioluminescência representa uma nova técnica útil para a sobrevivência da célula de acompanhamento após o transplante . Nós gerado com sucesso fibrina baseado EHT contendo luciferase positivo (luc +) células do coração pela adaptação de um pro...

<ul><li> LEW-Tg (Gt (ROSA) 26Sor-luc) 11Jmsk ratos (NBPR número de ratos 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) </li><li> Fibrinogênio bovino (solução estoque: 200 mg / ml, mais aprotinina 5 mg / ml em NaCl fibrinogênio 0,9%, Sigma F4753) </li><li> Matrigel (BD Bioscience 356235) </li><li> DMEM (Biochrome F0415) </li><li> Soro de cavalo (Gibco 26050) </li><li> Penicilina estreptomicina / (Gibco 15140) </li><li> Insulina (Sigma-Aldrich I9278) </li><li> Aprotinina (Sigma Aldrich A1153) </li><li> d-luciferina (Biosynth L-8220) </li><li> Imunoenzimático spot (ELISpot) placas de ensaio (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99) </li></ul>

imagem bioluminescência para avaliação das respostas imune após o implante do tecido do coração engineered (eht)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Várias técnicas de engenharia de tecido cardíaco foram perseguidos nas últimas décadas, incluindo estratégias de andaimes utilizando materiais nativa ou bioartificial andaime, aprisionamento de miócitos cardíacos em hidrogéis, tais como fibrina ou colágeno e empilhamento de monocamadas miócitos 1. Esses conceitos visem a restauração de comprometimento da função cardíaca (por exemplo, após infarto do miocárdio) ou como modelos experimentais (por exemplo, toxicologia preditiva e triagem substância ou modelagem de doença). Monitoramento preciso de sobrevivência das células após o implante do tecido do coração engenharia (EHT) tornou-se possível usando in-vivo de imagem de bioluminescência (BLI) técnicas de 2. Aqui, descrevemos a geração de fibrina baseado EHT de uma linhagem de ratos transgênicos com expressão ubíqua de firefly luciferase (ROSA / luciferase-LEW Tg; 3). Implantação é realizada no omento maior de linhagens de ratos diferentes para avaliar a resposta imune do organismo receptor após a implantação EHT. Comparação dos resultados gerados pelo BLI e Enzyme Linked Immuno Technique spot (ELISPOT) confirmam a usabilidade de BLI para a avaliação das respostas imunes.

Este vídeo demonstra o uso de<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de bioluminescência para estudar as respostas imune após o implante do tecido do coração Engineered (EHT) em ratos.

Imagem bioluminescência para avaliação das respostas imune após o implante do tecido do coração Engineered (EHT)

Diversas técnicas de engenharia de tecido cardíaco foram exploradas nas últimas décadas, incluindo estratégias de andaimes utilizando tanto nativos ou...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar a imagem de bioluminescência in vivo para estudar respostas imunes após o implante de tecido cardíaco engenheiro ou TCE em ratos. Isso é alcançado primeiramente pela geração de EHS positivos para luciferase. Em seguida, EHS que expressam luciferase de forma estável são transplantados para o epíploo maior de ratos receptores.Em seguida, pode-se realizar imagem de bioluminescência in vivo em animais receptores para monitorar de forma não invasiva a sobrevida e rejeição do EHT ao longo do tempo. Utilizando este modelo, a intensidade e a cinética da rejeição aguda, por exemplo, podem ser correlacionadas com a diminuição da intensidade do sinal de bioluminescência observado ao longo do tempo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a histologia, é que medições diárias permitem uma avaliação não invasiva e longitudinal da sobrevida do enxerto.Este método pode fornecer informações sobre a sobrevivência e rejeição de tecidos cardíacos engenheirizados, mas também pode ser aplicado a outras questões. Por exemplo, o metabolismo de ehs. A técnica bili será demonstrada por Christiana Parman, que realiza essa técnica diariamente.Em meu laboratório, células cardíacas transgênicas são inicialmente isoladas de ratos neonatais luciferase Lu para gerar DHT baseado em fibrina para fins de implante, preparando uma mistura mestra contendo células isoladas de corações de ratos transgênicos luciferase Lu neonatais, fibrinogênio bovino e matrigel em X-D-M-E-M e NKM. Prepare moldes de fundição de aros adicionando nove mililitros de aros 2% em PBS a cada poço de placas de cultura de seis poços e, em seguida, colocando espaçadores de teflon nos poços. Após a solidificação do aros, remova os espaçadores e coloque grades de postes de silicone nas placas de cultura com os postes alcançando os moldes.Para gerar EHT, misture suavemente o mix mestre, então adicione uma quantidade calculada de trombina ao mix mestre e misture brevemente. Em seguida, pipete rapidamente 1100 microlitros do mix mestre para cada molde. Após a polimerização do fibrinogênio, remova cuidadosamente as grades com os pinos que agora possuem EHT aderente dos moldes de fundição em agros e transfira as grades para novas placas de cultura celular de seis poços contendo oito mililitros de meio personalizado por poço.Os EHT são mantidos por 10 dias em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 7% de dióxido de carbono. O meio é trocado três vezes por semana. Durante este período de cultura, as células cardíacas de ratos neonatos começarão a se alongar, interconectar e alinhar ao longo das linhas de força entre os postes de silicone.No momento da implantação, serão observadas contrações espontâneas e coerentes. Esterilize os instrumentos para cirurgia em autoclave antes do uso e aqueça 30 mililitros de solução salina estéril. Os ratos para implantação devem pesar entre 100 e 150 gramas e ser mantidos em condições convencionais, com ração padrão para ratos e água ad libitum.Neste vídeo, ratos marrom da Noruega são utilizados após anestesia; sedar os ratos antes da cirurgia e confirmar a sedação pela ausência de resposta ao aperto dos dedos dos pés enquanto o rato está sob anestesia; injetar cinco miligramas por quilograma de peso corporal, carens subcutaneamente no dorso, raspar a área abdominal e aplicar pomada nos olhos para evitar que os olhos do animal sequem. Durante a anestesia, desinfetar a área abdominal utilizando Betadine e, em seguida, fazer fricção com etanol 80% de limpo para sujo. Repetir esta desinfecção.Dê três passos, cubra o animal e realize uma incisão abdominal mediana, separando a pele e o músculo em dois passos para abrir a cavidade abdominal. Utilize a esterilização por conta quente nas ferramentas entre os cortes. Umedeça uma luva sem pó com a solução salina.Coloque os intestinos dentro da luva. Dobre a luva ao redor dos intestinos para evitar a perda de umidade. Abra a incisão e exponha o baço.Identifique e espalhe o maior momento com pin&ccedil;as. Corte cuidadosamente o EHT dos postes de silicone suspensos e transfira-o para o maior momento. Enrole o maior momento ao redor do EHT e fixe-o fechado usando dois pontos simples de prolenas de sete oh.Em seguida, reposicione os intestinos dentro da cavidade abdominal. Lave a cavidade abdominal com um mililitro de solução salina estéril pré-aquecida. Feche a camada muscular da parede abdominal utilizando seis pontos contínuos de proleno 6-0.Utilize cinco pontos de sutura corridos de poliprolina para fechar a pele, proporcionando analgesia suficiente para este tipo de procedimento. Administre 50 miligramas por 100 mililitros de ole na água de beber durante três dias após a implantação. A plataforma de bioimagem IVUS é utilizada para imagem não invasiva de bioluminescência in vivo, e os resultados são analisados com o software IVUS Living Image.O exame de imagem é realizado diariamente, iniciando-se duas horas após a cirurgia. Antes de visualizar a bioluminescência do EHT, anestesie a rata e confirme a sedação por meio de pinçamento do dedo do pé. Desinfete a área abdominal.Injete Lucifer a 375 miligramas por quilograma de peso corporal inicialmente e coloque a rata anestesiada na câmara de imagem ivu. Até quatro ratas podem ser analisadas ao mesmo tempo. Utilize o software de imagem viva IVUS para observar e registrar o sinal de pico, que aparece aproximadamente 20 minutos após a injeção de Lucifer.Em seguida, estabeleça a intensidade do sinal de base de células positivas para luciferase dentro do EHT em unidades de fótons por segundo por centímetro quadrado por Ceridian na região de interesse, 120 minutos após o implante e nos dias 1, 2, 3, 5, 7, 10 e nas semanas dois, três e quatro. Os dados podem ser expressos na forma de gráfico, mostrando a intensidade do sinal ao longo do tempo. As respostas imunes celulares in vivo em Brown, Norway imunocompetentes e imunodeficientes.Ratos nu foram estudados após a implantação de EHT; os cítos SP receptores foram colhidos cinco dias após a implantação de EHT. A expressão de interferon-gama e IL-4 foi avaliada por ensaios lispa utilizando EHT inibido por mitomicina como estimuladores e cinco vezes 10 elevado à sexta potência de cítos receptores como células responsivas. As respostas TH1 e TH2 foram significativamente mais altas no modelo imunocompetente comparado ao modelo imunodeficiente, conforme evidenciado pela produção de interferon-gama e IL-4, respectivamente.EHS positivos para LUCIFERASE foram transplantados no omento maior de ratos PN imunocompetentes ou de ratos nus imunodeficientes. A sobrevivência celular foi acompanhada longitudinalmente por imagem de bioluminescência (BLI). A taxa de animais que rejeitaram os EHS transplantados é apresentada.Todas as ratas BN rejeitaram rapidamente os transplantes de EHT, enquanto as células sobreviveram em ratos deficientes em linfócitos T. Uma vez dominadas, as cirurgias podem ser realizadas em minutos, se a técnica for executada corretamente após a cirurgia. Outros métodos, como ensaios imunológicos e histologia, podem ser realizados para responder outras questões relacionadas à infiltração celular e resposta humoral.

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