Name: Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a rotular linhagens celulares em embriões de zebrafish usando fluoresceína engatilhada e laser UV. Este método permite rastrear o destino de células específicas através de microscopia de imunofluorescência em biologia do desenvolvimento.

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Gostaríamos de agradecer a Dan Carlin para ajudar na tomada de fluoresceína enjaulado. Além disso, gostaríamos de agradecer as fontes de financiamento seguintes: Vanderbilt University Medical School Programa de Grant Developmental Biology Formação de JAC, e NIH HD054534to JTG.

1. Síntese do Caged Fluorescein Dextran <ol><li> Meça 3,5-4 mg de aminodextran e adicione dentro do tubo Invitrogen fornecidos matizado contendo 1 mg de fluoresceína CMNB gaiolas SE. Em nossas mãos esta relação dá uma carga média de ~ 2,5 moléculas de corante por dextran. </li><li> Adicionar 500 mL de 0,1 M 2 B Na 4 tampão O 7 (borato de sódio) para o tubo. </li><li> Cap e vortex por 30 segundos para dissolver o aminodextran e fluoresceína enjaulado. </li><li> Vamos reagir durante a noite em um misturador de vórtice. </li><li> Retire a parte inferior de fechamento em uma coluna de spin Zeba e soltar a tampa. Marcar um ponto na coluna com uma caneta de feltro. Coloque em uma coluna de tubo de 15 mL cônico. </li><li> Centrifugar a 1000 xg por 2 min com o ponto de frente para o centro do rotor. Use coluna imediatamente após a compactação. </li><li> Colocar a coluna compactada em um tubo de 15 mL nova cônico. </li><li> Mistura piscina reação e transferência para o centro da cama compactado coluna de resina. Recoloque a tampa. </li><li> Centrifugar a 1000 xg por 2 min com o ponto de frente para o centro do rotor. Após a rodada, o eluente eo topo da coluna será mais ou menos o mesmo tom de cor amarela. </li><li> Transferir o eluente amarelo (~ mL 350) a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Lyophilize à secura em um speedvac. Cobrir o speedvac com papel alumínio. </li><li> Re-suspender a ~ 2-3 mg resultantes de espuma amarelada na água para uma concentração final de 1% w / v. </li><li> Conservar a solução a -20 ° C em folhas cobertas de tubos. É uma boa idéia para a solução de dextran alíquota para evitar congelamento e descongelamento repetitivos. </li></ol> 2. A injeção de fluoresceína Caged Dextran em embriões Zebrafish <ol><li> Diluir 1% de ações w / v de fluoresceína enjaulado dextran 1:05 ou 1:10 em KCl 0,2 M. </li><li> Injetar 0,5 - 1.0nL de solução de fluoresceína enjaulado na gema de uma célula de embriões palco usando uma pressão injector. Uma vez injetadas, embreagens de embriões devem ser mantidos no escuro a 28,5 ° C para reduzir a não-específica uncaging. </li><li> Remover manualmente córions a partir de embriões. </li><li> Anestesiar embriões em tricaina 4%. </li><li> Embriões serão montados em agarose 0,8% em 35mmx10mm placa de Petri, em seguida, cobertos com água de ovo. </li><li> Equilibrar agarose derretida em 50 bloco de aquecimento ° C por pelo menos 15 minutos. </li><li> Usando uma pipeta de vidro, elaborar um embrião em uma quantidade mínima de água e colocá-la no Nota agarose:. É importante para resfriar o tubo de agarose em sua mão por aproximadamente 30 segundos antes de colocar o embrião para dentro do tubo para evitar matar o embrião. </li><li> Pipetar o embrião do tubo, juntamente com cerca de 50μL de agarose e ejetar o conteúdo para o centro da placa de Petri. </li><li> Orientar rapidamente o embrião usando um fio de plástico com as células a serem uncaged voltada para cima. Nota: A agarose com frio rapidamente para ser apressada com a orientação do embrião. Embriões podem ser danificadas se manipulada após a agarose torna-se rígida. </li><li> Permitir que a agarose para solidificar completamente (este processo leva alguns minutos) e encher o prato dois terços cheio com água contendo ovos tricaina 4% e 0,003% PTU. </li></ol> 3. Laser Uncaging de fluoresceína Dextran <ol><li> O microscópio utilizado para uncaging deve ter uma objetiva de imersão 40X água. </li><li> Nós usamos um Photonics Instruments laser com a célula de 365 nm corante e os 70% / 30% dividido espelho dicróico. </li><li> Antes de uncaging, o laser deve ser feita com o objetivo parfocal e atenuada com a potência adequada. </li><li> Para focar o laser, coloque uma lâmina de vidro espelhado com o objetivo e foco o objetivo até arranhões no slide são visíveis. </li><li> Ajustar a laser atenuador até que o laser pode produzir um risco claramente visível no espelho com um único pulso. </li><li> Ajuste o foco objetivo cima e para baixo. Se o laser pode produzir um risco quando o objetivo é fora de foco, ajustar o foco do laser ¼ de volta para cima ou para baixo. Repita até que o laser pode riscar apenas quando o objetivo é focada. </li><li> Lugar montado embrião no âmbito do objectivo e focar a área a ser uncaged. </li><li> Para soltar da jaula, o foco em uma célula de interesse e de pulso que 10-20 vezes menos 2-3 Hz. </li><li> Depois uncaging, embrião do livre por raspagem agarose afastado com uma pinça e colocá-los em água contendo ovos PTU 0,003%. Deixe os embriões se desenvolvem em uma caixa à prova de luz até que sejam corrigidos. </li></ol> 4. Rotulagem de anticorpos e Detecção de Fluoresceína Uncaged Dextran <ol><li> Fix embriões em Ab fixadora (paraformaldeído 4%, 0,3 CaCl 2, 8% de sacarose, fosfato de 1X tampão pH, solução salina 7,3) por 2-4 horas à temperatura ambiente (RT) ou durante a noite (O / N) a 4 ° C. Manter os embriões em uma caixa de luz apertado ou embrulhado em papel alumínio do tubo para todas as etapas rotulagem. </li><li> Remover fixador e substituir com MeOH 100%, deixe por 10 minutos a RT, remova e substitua MeOHce com MeOH 100% fresco. </li><li> Loja em MeOH a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos. Nota: Você pode armazenar em MeOH por até duas semanas antes de começar a degradar epitopos. </li><li> Reidratar embriões com 5 lavagens minuto a RT de 75% de fosfato MeOH/1X solução salina tamponada com 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), então 1XPBTw 50% MeOH/50%, então 25% MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li> Lavar três vezes por 5 minutos em 1XPBSTw. </li><li> Se os embriões são&gt; 24 horas de idade, permiabilize embriões com 10 mcg / mL proteinase K em 1XPBSTw. Permiabilization tempo é dependente no palco. Cinco minutos em proteinase K é suficiente se os embriões são entre 24 e 48 horas pós-fertilização (hpf). Mais tempo pode ser necessária se para mais larvas. Re-fix em Ab fixadora por 20 minutos a RT </li><li> Lavar cinco vezes por 5 minutos em 1XPBSTw na RT. </li><li> Incubar em solução de bloco (1XPBS, Triton x100 0,1%, 10% de soro de ovelha, 10% de soro bovino albumina, 1% Dimetil sulfóxido) por 1-2 horas em temperatura ambiente. </li><li> Diluir anticorpos primários (anti-fluoresceína mais anticorpos contra células do tipo marcadores específicos) em solução de bloqueio. </li><li> Embriões incubar S / N, 4 ° C em solução contendo anticorpos primários. </li><li> Lavar quatro vezes por 20 minutos em 1XPhosphate Buffered Saline com Triton x100 0,1% (PBSTx) em temperatura ambiente. </li><li> Diluir fluorescente marcado com anticorpos secundários (geralmente 1:300) em solução de bloqueio. </li><li> Incubar S / N, 4 ° C em solução contendo anticorpos secundários. </li><li> Lavar quatro vezes por 20 minutos em 1XPBSTx na RT. </li><li> Embriões claro em 50% 1XPBS glycerol/50% para pelo menos duas horas em temperatura ambiente, em seguida, remover o glicerol / PBS mistura e adicione glicerol 100% e deixe descansar O / N a 4 ° C. </li></ol> 5. Resultados representativos: Depois de imunomarcação, deve haver uma área enriquecida de coloração nas células que foram uncaged (Figura.1). Não é incomum ver um sinal relativamente alta-ruído em&gt; zebrafish 48 horas de idade, devido a uncaging espontânea da fluoresceína. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Lineage rotulagem de zebrafish complexo pineal. Aos 24 hpf, uma parte do primórdio anterior pineal, indicado por foxd3:. Expressão GFP, foi uncaged utilizando pulsos de laser UV A) Ao 48hpf, um cluster do lado esquerdo de células chamado de parapineal (círculo vermelho) surgiu a partir da uncaged domínio (círculo branco). B) sinal de fluoresceína Uncaged é enriquecido no círculo (parapineal vermelho) e do órgão pineal (círculo branco).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Como descrito, este protocolo fornece um método de rotulagem relativamente rápido linhagem em zebrafish que é construída sobre as técnicas comumente usadas de microinjeção, microscopia e de imunofluorescência. Nós descobrimos que o laser uncaging ser a forma mais eficiente e de custo eficaz para libertar da gaiola de fluoresceína de uma forma localizada. Este método poderia ser usado para rotular linhagem com pontos de extremidade experimental tão tarde como 4 dpf. No entanto, como as células se dividem, a concentração ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-caged fluorescein SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodextrana, 10 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de centrifugação para dessalinização Zeba</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo de cabra anti-fluoresceína</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo Alexa Fluor 633 de jumento anti-cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 35 mm x 10 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>microscópio composto ereto com objetiva de imersão em água 40x</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema manual de iluminação a laser MicroPoint</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feniltioureia (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>filamento plástico</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>misturador vortex</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>injetor de pressão</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem de linhagem de células zebrafish com laser uncagable fluorescein dextran

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Um problema central na biologia do desenvolvimento é deduzir a origem da miríade de tipos de células presentes nos vertebrados que possam surgir a partir de precursores indiferenciados. Pesquisadores têm utilizado diversos métodos de rotulagem linhagem, como DII rotulagem 1 e injeção de pressão de enzimas rastreáveis ​​2 para verificar o destino de células em fases posteriores de desenvolvimento em sistemas-modelo. Os mapas destino primeiro peixe-zebra (Danio rerio) foram montados por meio de injeção de iontoforese de corantes fluorescentes, tais como a rodamina dextran, em células isoladas em regiões discretas do embrião e rastreamento destino da célula marcada ao longo do tempo 3-5. Apesar de eficaz, estes métodos são tecnicamente exigentes e que requerem equipamento especializado não comumente encontrados em laboratórios de zebrafish. Recentemente, photoconvertable proteínas fluorescentes, como o Eos e Kaede, que irreversivelmente mudar de verde para vermelho quando fluorescência expostos à luz ultravioleta, estamos vendo maior utilização em zebrafish 6-8. A claridade óptica do embrião zebrafish ea relativa facilidade de transgênese têm feito essas ferramentas particularmente atraente para a rotulagem de linhagem e de observar a migração das células in vivo 7. Apesar de sua utilidade, essas proteínas têm algumas desvantagens em comparação com corante mediada métodos de rotulagem linhagem. Crucial a maioria é a dificuldade que temos encontrado na obtenção de resolução em 3-D de alta durante fotoconversão destas proteínas. A esta luz, talvez a melhor combinação de resolução e facilidade de uso para a rotulagem linhagem em zebrafish faz uso de gaiolas de fluoresceína dextran, um corante fluorescente que é vinculado a um grupo de têmpera que mascara seus 9 de fluorescência. O corante pode ser &quot;uncaged&quot; (lançado a partir do grupo quenching) dentro de uma célula específica usando a luz UV de uma lâmpada a laser ou mercúrio, permitindo a visualização de sua fluorescência ou imunodetecção. Ao contrário dos métodos de iontoforese, fluoresceína enjaulado pode ser injetado com aparelhos de injeção padrão e uncaged com um microscópio de epifluorescência equipado com uma pinhole 10. Além disso, anticorpos contra fluoresceína detectar apenas a forma uncaged, eo epítopo sobrevive bem fixação 11. Finalmente, fluoresceína enjaulado pode ser ativada com muito alta resolução 3-D, especialmente se a microscopia de dois fótons é empregada 12,13. Este protocolo descreve um método de rotulagem linhagem de fluoresceína enjaulado e uncaging laser. Subsequenctly, uncaged fluoresceína é detectado simultaneamente com outros epitopos, como GFP pela marcação com anticorpos.

Este protocolo delineia uma forma de rótulo e traçar o destino de pequenos grupos de células de embriões zebrafish utilizando UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido por montar todo imunomarcação para amplificar o sinal da fluoresceína uncaged.

Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Um problema central na biologia do desenvolvimento é deduzir a origem dos inúmeros tipos celulares presentes nos vertebrados à medida que estes surgem de células indiferenciadas...

O objetivo geral deste procedimento é marcar linhagens celulares em um embrião de peixe-zebra. Isso é realizado primeiramente sintetizando fluoresceína encoberta e injetando-a nos embriões de peixe-zebra. Em seguida, os embriões são montados em ágar para que as células a serem marcadas fiquem acessíveis.Em seguida, um laser UV é usado para ativar a fluoresceína contida em células selecionadas do embrião. Por fim, os embriões são coletados após atingirem o estágio desejado e as células marcadas são detectadas em relação a marcadores de linhagens específicas. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram o destino de células selecionadas nos embriões por meio da liberação fotoativa e da microscopia imunofluorescente.A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como a conversão fotônica de Cade, é que a imunofluorescência multicolorida pode detectar fluoresceína desprotegida, além de outros anticorpos específicos para marcadores celulares. Para injetar dextrana de fluoresceína protegida em embriões de peixe-zebra, primeiramente sintetize-a e prepare uma solução a 1% peso por volume. Aliquote o estoque de acordo com o protocolo escrito anexo.Em seguida, alíquota do diluente, uma para cinco ou uma para 10 em cloreto de potássio 0,2 molar. Em seguida, injete 0,5 a um nanolitro de solução de fluoresceína coqueluchada no vitelo de embriões de um estágio celular. Após a injeção com um injetor de pressão, os grupos de embriões devem ser mantidos no escuro a 28,5 graus Celsius para reduzir a liberação não específica no estágio de desenvolvimento desejado.Remova manualmente a coroa dos embriões, anestesie os embriões em 4% trica para montar os embriões em equilíbrio, 0,8% aros fundido em um bloco de aquecimento a 50 graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Em seguida, resfrie o tubo na sua mão por aproximadamente 30 segundos. Antes de adicionar os embriões usando uma pipeta de vidro, aspire um embrião com uma quantidade mínima de água e libere-o no aros. Pipete o embrião do tubo junto com aproximadamente 50 microlitros de aros e expulse o conteúdo no centro de uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros.Usando um fio plástico, oriente rapidamente o embrião com as células a serem desgaioladas voltadas para cima. Deixe o aros solidificar completamente e preencher o recipiente. Preencha dois terços com água de ovo contendo 4% trica e 0,003% PTU e mantenha os embriões em uma caixa à prova de luz até o momento da desgaiolagem.Para realizar o laser na contenção de dextrana de fluoresceína, utilize um microscópio composto com uma objetiva de imersão em água de 40x. Utilizamos um laser de instrumentos fotônicos com uma célula de corante de 365 nanômetros e um espelho dicromático com divisão de 70%30% antes da dessilenciamento. O laser deve ser tornado parfocal com a objetiva e atenuado à potência apropriada para focar o laser.Coloque uma lâmina de vidro espelhada sob a objetiva e foque a objetiva até que arranhões na lâmina sejam visíveis. Ajuste o atenuador do laser até que o laser produza um arranhão claramente visível no espelho com um único pulso, ajustando o foco da objetiva para cima e para baixo. Se o laser puder produzir um arranhão quando a objetiva estiver desfocada, ajuste o foco do laser em um quarto.Aumente ou diminua. Repita até que o laser consiga riscar o espelho. Somente quando o objetivo estiver focado, coloque o embrião montado sob o objetivo e foque na área a ser desgaiolada para realizar a desgaiolagem.Foque uma célula de interesse e estimule-a 10 a 20 vezes a uma frequência de dois a três hertz. Após a liberação da cápsula. Libere o embrião removendo os cerdas com pinça e coloque-os em água de ovo contendo PTU 0,003%. Fixe os embriões em fixador com anticorpo por duas a quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius.Remova o fixador e substitua por metanol a 100%. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o metanol e substitua por metanol fresco a 100%.Armazene os embriões em metanol a menos 20 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. É possível armazenar em metanol por até duas semanas antes que os epítopos comecem a degradar. Reidrate os embriões com lavagens de cinco minutos à temperatura ambiente de 75% metanol, 25% PBS tamponado com fosfato 1x com 0,1% tween 20; 50% metanol, 50% PBS 1x com tween 20; depois 25% metanol, 75% PBS 1x com tween 20, lavando três vezes por cinco minutos em PBS 1x com tween 20.Se os embriões tiverem mais de 24 horas, permeabilize-os com 10 microgramas por mililitro de Proteinase K em XPBS com tween 20. O tempo de permeabilização depende do estágio do embrião. Cinco minutos em protease K são suficientes.Se os embriões tiverem entre 24 e 48 horas pós-fertilização, pode ser necessário mais tempo para larvas mais velhas. Refixe com um fixador de anticorpo por 20 minutos à temperatura ambiente. Lave os embriões cinco vezes, durante cinco minutos cada, em PBS-X com tween 20, à temperatura ambiente.Em seguida, incubar na solução bloqueadora por uma a duas horas à temperatura ambiente. Diluir os anticorpos primários na solução bloqueadora. Em seguida, incubar os embriões durante a noite a quatro graus Celsius em solução contendo os anticorpos primários; na manhã seguinte, lavar os embriões quatro vezes em XPBS com Triton X-100 e diluir os anticorpos secundários marcados com fluoróforo na solução bloqueadora.Incube os embriões durante a noite a quatro graus Celsius em solução contendo anticorpos secundários. Após lavar quatro vezes em XPBS com Triton X-100, clarifique os embriões em uma mistura de 50% de glicerol e 50% de XPBS por pelo menos duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, remova a mistura de glicerol e PBS e adicione glicerol a 100%, incubando durante a noite a quatro graus Celsius.Os resultados representativos para larvas controle e com liberação fotoquímica são mostrados na forma de projeções confocais. Embriões controle foram injetados com fluoresceína encapada, mas não submetidos à liberação fotoquímica 48 horas após a fertilização. O embrião controle exibe marcação com GFP no complexo pineal.Alguma marcação de fundo pontuada, mas não é detectável acúmulo localizado de fluoresceína marcada. Embriões com fotoativação mostram clara acumulação de fluoresceína fotoativada em algumas das células marcadas com GFP. Estas são as descendentes das células alvo da fotoativação realizada 24 horas antes, com pequenas modificações.Este procedimento pode ser utilizado para marcar linhagens de quase qualquer tecido no embrião de peixe-zebra antes de 48 horas pós-fertilização.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Células que morrem são extrudados a partir de tecidos epiteliais pela contração concertada de células vizinhas, sem interromper a função de barreira. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos métodos para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval em resolução celular.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

Função Espaçador Lipid (FSL) constrói permitir as características da superfície de células vivas e virions ser modificado sem perda de vitalidade. O método requer apenas simples contato de uma solução de construção de uma célula com FSL / virion e incorporação de superfície espontânea e estável ocorre.

FSL Constrói: Um método simples para modificar Cell / Virion superfícies com um intervalo de Marcadores Biológicos sem afectar a viabilidade

O desenvolvimento do peixe-zebra pode ser seguido ao longo de dias com microscopia folha de luz quando os embriões estão embutidos em tubos de polímero opticamente clara com agarose de baixa concentração.

Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Manipulações direcionadas para causar estresse direcionado ou morte em células individuais têm sido relativamente difíceis de realizar. Aqui, uma abordagem de ablação com resolução de célula única para estressar e matar seletivamente células individuais em cultura de células e animais vivos é descrita com base em um laser UV confocal padrão.

Provocando estresse celular e morte utilizando convencional UV laser microscopia confocal

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para marcar proteínas com uma etiqueta de proteína de fluorescência em larvas de peixe-zebra, um sistema in vivo recém-desenvolvido e modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baixa abundância em peixe-zebra.

Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

Aprenda a rotular linhagens celulares em embriões de zebrafish usando fluoresceína engatilhada e laser UV. Este método permite rastrear o destino de células específicas através de microscopia de imunofluorescência em biologia do desenvolvimento.

Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran

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