Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

O objetivo geral do experimento a seguir é ativar células T doadoras aloespecíficas recetoras por meio de estimulação ex vivo com antígenos alorecetores na presença de anticorpos que bloqueiam a coestimulação de células apresentadoras de antígeno às células T por meio de seus receptores CD28. Isso é realizado primeiramente isolando PBMC de dois doadores saudáveis diferentes. Em seguida, um cultivo em co-cultura para ativação aloespecífica em massa é montado incubando populações de PBMC incompatíveis quanto ao HLA na presença de anticorpos monoclonais contra os ligantes B7.1 e B7.2, a fim de bloquear a estimulação via CD28.

Em seguida, a eficácia da aloenergização é medida por reações primárias e secundárias de linfócitos mistos ou MLR. Por fim, a especificidade aloreactiva da aloenergização é avaliada mediante a determinação de respostas específicas contra terceiros e contra o CMV. São obtidos resultados que demonstram que os linfócitos T do doador tornam-se hiporresponsivos à estimulação subsequente por antígenos alógeneos, mas que os linfócitos T do doador não aloreativos permanecem intactos e funcionais.

Empregamos com sucesso essa estratégia em ensaios clínicos piloto anteriores e em andamento de infusão de linfócitos T alogênicos ativados durante e após transplante de células-tronco com incompatibilidade de HLA, observando uma reconstituição imune melhorada, menos infecções e doença enxerto contra hospedeiro aguda e crônica menos grave do que a observada em controles históricos de receptores de transplantes alogênicos não manipulados. Uma grande vantagem da estratégia de anodização alo é que os efeitos fora do alvo são minimizados, pois a técnica não reduz as respostas de linfócitos T específicas a patógenos ou antígenos associados a tumores, nem elimina as células T reguladoras CD4 do pool de linfócitos T do doador, demonstrando que o procedimento será realizado por Christine Vin, cientista colaboradora em nosso laboratório. O primeiro passo é coletar sangue de dois doadores voluntários saudáveis.

Células de um doador servirão como resposta e as células de outro doador servirão como estimuladoras. Em seguida, isole PBMC do sangue por centrifugação em gradiente de densidade usando fial pac. Mantenha uma pequena quantidade de células com trian blue e conte PBMC viáveis utilizando a câmara de contagem hemo citômetro reus.

Colocar PBMC de cada doador em 10 mililitros de meio de cultura completo, a uma concentração de 1 milhão de células viáveis por mililitro, em tubos cónicos separados de 15 mililitros. Designar um tubo de PBMC do doador como estimulador e o outro como respondedor para montar a co-cultura em bloco com ativação alo.

Adicione 100 microgramas dos anticorpos anti B 7.1 e anti B 7.2 ao tubo de 15 mililitros designado como estimulador. Agite suavemente o tubo e incube por 30 minutos após o período de incubação. Irradie os PBMC estimuladores e adicione-os a um frasco de cultura celular T 25 de 50 centímetros cúbicos com tampa permeável a gases.

Rotule o frasco com cultura em larga escala de alo-coal. Em seguida, adicione 10 mililitros de PBMCs respondedores do outro doador a 1 milhão por mililitro em meio completo ao frasco. Adicione mais 100 microgramas de cada um dos anticorpos 7.1 e Antib 7.2 ao frasco e misture suavemente antes de colocar o frasco na posição vertical em uma incubadora por 72 horas.

Em seguida, irradie outros 10 milhões de PBMCs estimuladores para uma cultura em co-cultura de controle em lote sem anticorpos bloqueadores e, então, adicione-os a um frasco de cultura celular T 25 de 50 centímetros cúbicos. Rotule o frasco como cultura em co-cultura de controle em lote. Adicione 10 mililitros dos mesmos PBMCs respondedores utilizados na cultura em co-cultura aloestimuladora em lote, a 1 milhão por mililitro em meio completo, ao frasco e misture suavemente antes de colocar o frasco na posição vertical em uma incubadora por 72 horas.

O próximo passo é medir a função do pool de células T doadoras ativadas pelo alo nos mesmos dias em que são rotuladas as culturas coletivas em massa. Rotule uma placa de 96 poços em formato de U para cada um dos três pontos temporais a serem medidos. Em seguida, transfira cinco mililitros de cada uma das culturas co-cultivadas controle em massa e ativadas pelo alo para tubos de 15 mililitros.

Em seguida, pipete 200 microlitros de suspensão celular de cada tubo em poços triplicados em cada uma das três placas. Rotule esses poços como sem bloqueio coestimulatório ou sem CSB para as células das culturas frias de controle em massa e CSB para as células das culturas frias aloestimulantes em massa. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio completo a seis poços em cada placa como controles negativos.

Por fim, adicione 200 microlitros de PBS a todas as poças vazias para reduzir a evaporação e coloque as placas no incubador 72 horas após o preparo das culturas coletivas. Rotule uma placa de 96 poços UBO como MLR secundário para cada um dos três pontos temporais a serem medidos. Para preparar as células respondedoras para o MLR secundário, transfira cinco mililitros de cada uma das culturas coletivas de controle e aloestimulantes para tubos de 15 mililitros e centrifugue os tubos por cinco a 10 minutos a 2000 RPM em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células mais duas vezes, aspirando cuidadosamente os sobrenadantes, desfazendo os pellets, adicionando 10 mililitros de meio completo a cada tubo e, então, centrifugue novamente as células após a segunda lavagem.

Resuspenda as células em um mililitro de meio completo. Utilize a coloração com azul de tripano para enumerar as células viáveis e ajuste a concentração celular para 1 milhão de células respondedoras viáveis por mililitro. Pipete 100 microlitros da suspensão celular de cada tubo em poços triplicados de cada placa.

Rotule essas poças como estimulação de primeira parte ou liga FP. Em seguida, pipete 100 microlitros de suspensão celular de cada tubo para outras três poças em cada placa e rotule essas poças como estimulação CD3/28 PBMC do mesmo doador utilizadas para fornecer PBMC estimuladoras de primeira parte para o alo. Culturas co estimuladas e controle são usadas como células estimuladoras para MLR secundário: suspenda 10 milhões de PBMC do doador de primeira parte em uma concentração de 1 milhão por mililitro e irradie adicione.

100 microlitros de células estimuladoras irradiadas para os poços rotulados como fp de restimulação alo nos placas de MLR secundário. Para os controles positivos, adicione um microlitro de cada um dos anticorpos monoclonais CD3 e CD28 e 98 microlitros de meio completo aos poços rotulados como estimulação CD3 28 em cada placa de MLR secundário. Além disso, adicione 200 microlitros de meio completo a seis poços vazios em cada placa para servir como controles negativos e adicione 200 microlitros de PBS a todos os poços vazios para reduzir a evaporação.

Coloque as placas no incubador. O próximo passo é medir a especificidade do processo alo utilizando PBMC isoladas de um novo doador saudável denominado doador terceiro, que são usadas para testar a especificidade do processo alo em um MLR secundário. Suspenda os PBMC do doador terceiro a 1 milhão de células por mililitro e irradie, rotulando 3 placas de 96 poços para o MLR secundário de especificidade nos dias três, cinco e sete.

Para preparar as células efetoras para o MLR secundário destinado à medição da especificidade, transfira cinco mililitros de cada um dos cultivos co-cultivo controle em massa e estimulados alologicamente para tubos de 15 mililitros e centrifugue os tubos por cinco a 10 minutos a 2000 RPM. Em seguida, lave as células duas vezes aspirando cuidadosamente os sobrenadantes, ressuspendendo os pellets, adicionando 10 mililitros de meio completo a cada tubo e centrifugando novamente as células após a segunda lavagem. Ressuspenda as células em um mililitro de meio completo.

Utilize a coloração com azul de tripano para contar as células e ajuste a concentração celular para 1 milhão de células respondedoras viáveis por mililitro e, em seguida, pipete 100 microlitros de suspensão celular de cada tubo em poços triplicados em cada placa. Identifique esses poços como TP ou estimulação alógena de terceiro partido. Em seguida, adicione 100 microlitros de células estimuladoras TP irradiadas aos poços identificados como estimulação alógena TP.

Para testar ainda mais a especificidade das respostas alo, as respostas a patógenos são medidas após a ativação de PBMC de doadores com respostas proliferativas previamente estabelecidas ao CMV. Rotule as placas de 96 poços M-L-R-C-M-V para os dias três, cinco e sete, e transfira cinco mililitros de cada cultura de controle em larga escala e de culturas de ativação alo para tubos de 15 mililitros. Em seguida, lave, conte e re-suspenda as células a 1 milhão por mililitro em meio completo. Pipete 100 microlitros da suspensão celular de cada tubo em três poços de cada placa, e rotule esses poços como estimulação CMV.

Em seguida, adicione 0,1 microlitros de lisado de CMV em 100 microlitros de meio completo aos poços rotulados como estimulação com CMV. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio completo a seis poços de cada placa como controles negativos. Por fim, adicione 200 microlitros de PBS a todos os poços vazios para reduzir a evaporação e coloque as placas no incubador para medir a proliferação no MLR primário e secundário.

Adicione um microcurie de timidina tritiada aos poços do controle negativo e aos poços contendo células, 16 horas antes da colheita das placas. Colete a timidina em um filtro-matriz para cada placa utilizando um colheitador TomTec ou sistema de ar semelhante. Seque os filtros-matriz por uma hora.

Em seguida, coloque-os em sacos amostrais individuais. Adicione cinco mililitros de fluido de cintilação a cada um e feche. Meça a incorporação de tri-timidina nas últimas 16 horas do experimento lendo as placas de filtro com um contador de cintilação Wallach Micro Beta ou equipamento similar, utilizando PBMCs estimuladores e responsivos com incompatibilidade de HLA.

Pode-se observar nesta figura que a presença de bloqueio coestimulatório na MLR primária reduz a proliferação aloestimulada média de PBMCs responsivos no dia cinco a cerca de 30% daquela observada na MLR primária controle na ausência de bloqueio coestimulatório. Isso equivale a uma inibição média da proliferação aloestimulada primária de cerca de 70% no dia cinco. Conforme observado nesta figura.

Pode-se observar nesta figura que, no MLR secundário, a proliferação alo-réativa de PBMCs alo-ativados no quinto dia é tipicamente de 10 a 15% daquela observada com PBMCs controle. Isso equivale a uma inibição média da proliferação de 85 a 90%, demonstrando que os PBMCs alo-ativados são hiporresponsivos a estimuladores alo da primeira parte. Como visto nesta figura, uma vez dominada, a cultura coletiva em larga escala com células mononucleares do sangue periférico do doador alo-ativadas pode ser estabelecida em duas a três horas.

A abordagem pode ser facilmente padronizada para uso clínico, a fim de gerar linfócitos T doadores com reatividade alo específica reduzida, mas com imunidade específica contra patógenos preservada. Tais células podem ser transferidas adotivamente no contexto de transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas para melhorar a reconstituição imune sem doença enxerto contra hospedeiro excessiva. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente.

Isso ajuda a preservar a viabilidade das células e evitar a ativação inespecífica ou a perda de células apresentadoras de antígenos. Se forem utilizados PBMCs criopreservados como estimuladores ou respondedores, deve-se empregar um protocolo validado para o ressuscitamento de células congeladas que forneça consistentemente altos rendimentos de células viáveis. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aloenriquecer células mononucleares do sangue periférico de doadores humanos e como realizar ensaios para avaliar a eficácia e especificidade deste procedimento; a estratégia pode ser usada para gerar linfócitos T de doadores humanos com respostas aloreativas reduzidas, que podem ser utilizadas clinicamente para melhorar a reconstituição imune após transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.