Name: Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis 3 Sistema Dimensional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprenda a encapsular folículos ovarianos em rede de fibrina-alginato 3D para cultivo in vitro. Este método mantém a arquitetura folicular e suporta a comunicação celular durante a maturação de oócitos em camundongos.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH (U54HD41857 e PL1EB008542, um Núcleo de Biomateriais P30 dentro do Consórcio Oncofertility Roteiro de subvenção).

<ol><li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+maturation%2C+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li>
<li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li>
<li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li>
<li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture%2C+in+vitro+follicle+development+and+transplantation%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li>
<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li>
<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+micro+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ovário apresenta método de encapsulamento em um folículo FA-IPN permite folículo cultura em um ambiente 3D in vitro. A FA-IPN é um processo dinâmico, a matriz de células de resposta em que as propriedades mecânicas iniciais são determinados pela combinação de ambos fibrina e alginato. Durante a cultura, o folículo encapsulado ativa proteases que degradam apenas um componente do IPN, a fibrina, que resulta em um gel, diminuindo gradualmente a rigidez que é contribuição apenas pelo alginato remanescente no fina...

<table><tbody><tr><td>Fetuína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Roche Group</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00475</td><td>40 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>rFSH</td><td>Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884-1VL</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM+Gluta MAX</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>32561</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Estrep</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28379</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Fibrina Tisseel</td><td>Baxter International Inc.</td><td>921030</td><td></td></tr><tr><td>Alginato de Sódio</td><td>FMC BioPolymers</td><td>LF200DL</td><td>Mw 418kDa</td></tr></tbody></table>

um método para encapsulation ovário folículo e cultura em um proteoliticamente degradáveis ​​3 sistema dimensional

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

O folículo ovariano é a unidade funcional do ovário que secreta hormônios sexuais e suporta maturação de oócitos. Em técnicas folículo vitro fornecer uma ferramenta para o desenvolvimento folicular modelo a fim de investigar a biologia básica, e são ainda a ser desenvolvido como uma técnica para preservar a fertilidade do clínica 1-4. Nosso sistema de cultura in vitro emprega hidrogéis, a fim de imitar o ambiente nativo do ovário, mantendo a arquitetura folicular 3D, interações célula-célula e sinalização parácrina que o desenvolvimento folicular direta 5. Anteriormente, os folículos foram cultivados com sucesso em alginato, um polissacarídeo derivado de algas inerte que sofre gelificação com íons de cálcio 6-8. Hidrogéis de alginato formado em uma concentração de 0,25% w / v foram os mais permissiva para a cultura do folículo, e manteve a mais alta competência de desenvolvimento 9. Hidrogéis de alginato não são biodegradáveis, portanto, um aumento nos resultados folículo de diâmetro em uma força de compressão sobre o folículo que podem impactar o crescimento do folículo 10. Nós posteriormente desenvolvido um sistema de cultura baseado numa rede de fibrina alginato-interpenetrantes (FA-IPN), em que uma mistura de alginato de fibrina e são gelled simultaneamente. Esta combinação fornece um ambiente dinâmico mecânica, porque os dois componentes contribuem para a rigidez da matriz, inicialmente, no entanto, proteases secretadas pelo folículo crescente degradação de fibrina na matriz de alginato deixando apenas para prestar apoio. Com o IPN, o conteúdo de alginato pode ser reduzida abaixo de 0,25%, o que não é possível com alginato sozinho 5. Assim, como o folículo se expande, ele vai experimentar uma força de compressão reduzida devido ao teor de sólidos reduzidos. Aqui, descrevemos um método de encapsulamento e um em sistema de cultura in vitro para folículos ovarianos em um FA-IPN. O ambiente dinâmico mecânico imita o ambiente natural em que ovário folículos pequenos residir em um córtex rígido e mover para uma medula mais permissiva à medida que aumentam de tamanho 11. O componente degradável pode ser particularmente crítica para a tradução clínica, a fim de apoiar o maior aumento de 10 6 vezes no volume que os folículos humano normalmente sofrem in vivo.

Um novo método para encapsulação de ovário folículos em uma rede de fibrina 3D alginato-interpenetrantes é descrito. Este sistema combina suporte estrutural, com a degradação proteolítica para apoiar o desenvolvimento de folículos imaturos para produzir ovócitos maduros. Este método pode ser aplicado a agregados de cultura de células para manter contatos célula-célula sem limitar a expansão.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

O folículo ovariano é a unidade funcional do ovário que secreta hormônios sexuais e sustenta a maturação do oócito. Técnicas de folículos in vitro proporcionam...

Este protocolo descreve um novo método de encapsulação de folículos ovarianos em uma rede interpenetrada de fibrina-algina para cultura in vitro. O folículo secundário consiste em um oócito localizado centralmente, rodeado por várias camadas de células somáticas, que apoiam o desenvolvimento do oócito; o encapsulamento do folículo e a cultura em um ambiente tridimensional permitem a expansão folicular, ao mesmo tempo que sustentam a comunicação entre múltiplos compartimentos celulares e mantêm a estrutura esférica do folículo. Na primeira etapa deste protocolo, isole folículos secundários de ovários de camundongos com 16 dias de idade para o método de gota.Lave e transfira os folículos para uma solução de encapsulação. Aspire cada folículo com solução de alginato de fibrinogênio usando uma pipeta e transfira para uma solução de trombina com cálcio, permitindo que as microesferas sofram reticulação pelo método paraform. Transfira folículos individuais para gotas de solução de alginato de fibrinogênio sobre uma lâmina de vidro revestida com paraform e adicione solução de trombina para iniciar a reticulação F-A-I-P-N.Em seguida, transfira os folículos encapsulados para um meio de crescimento e realize a imagem do folículo encapsulado na IPN de FA. Uma vez que este sistema combina suporte estrutural com resposta biológica para promover o crescimento e desenvolvimento de folículos imaturos na produção de óvulos, ele pode ser aplicado para o cultivo de agregados celulares, mantendo os contatos célula-célula sem limitar a expansão. Olá, meu nome é Lonnie Shea e, por meio de uma colaboração com Three Fold Drip, desenvolvemos um sistema de cultivo para a maturação in vitro de folículos ovarianos.E este estudo de cultura reflete realmente uma colaboração genuína entre bioengenharia e biologia reprodutiva. E hoje, as pessoas que realmente desenvolveram este sistema de cultura irão apresentar os métodos a vocês. Primeiro, Ariel Checkoff é pesquisadora pós-doutora em bioengenharia, que desenvolveu o sistema de biomateriais.A seguir está Minsu, que é biólogo reprodutivo do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, e desenvolveu os procedimentos de manipulação do tecido ovariano. Juntos, eles apresentarão os métodos para encapsular e cultivar tecido ovariano. A principal vantagem da técnica descrita em relação aos métodos existentes, como o cultivo padrão em superfície plana de plástico, é que o sistema de alginato de fibrina sustenta a arquitetura tridimensional do folículo, ao mesmo tempo que oferece um ambiente mecanicamente dinâmico para o folículo em rápida expansão.O microambiente mecânico dinâmico no modelo atual oferece vantagens adicionais quando esta tecnologia é transferida do modelo em massa para a aplicação clínica potencial, pois o folículo humano necessita de um crescimento muito mais extenso para produzir óvulos maduros e fertilizáveis para resultados ideais. Realize todas as dissecações em meio baseado em L-15 para controle de pH, em estágios aquecidos a 37 graus Celsius para controle de temperatura e em bancada limpa para minimizar a contaminação bacteriana. Transfira os ovários recém-dissecados para um novo recipiente de Petri de 35 milímetros com um a dois mililitros de meio de manutenção contendo 0,1% de colagenase e 0,1% de DNAs e incube por 15 minutos em uma incubadora de dióxido de carbono.Lave as amostras em DM para remover a colagenase e, em seguida, transfira para uma placa de Petri de 35 milímetros com DM fresco para isolar os folículos do ovário. Agite suavemente os folículos para afastá-los do ovário inteiro usando duas agulhas de calibre 28 ½ acopladas a seringas de insulina. Remova o máximo de células estromais possível sem danificar a integridade do folículo.Disseque de 20 a 40 folículos secundários com diâmetro de 130 a 150 mícrons por ovário. Esses folículos geralmente possuem duas a três camadas de células granulosas. Agora, em uma placa de FIV, adicione um mililitro de mm no poço central e três mililitros de mm no anel externo.Transfira os folículos intactos com a pipeta para o anel externo da placa de FIV. Mantenha esta placa de FIV dentro do incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após todos os folículos serem coletados.Examine as amostras sob um microscópio estereoscópico com uma ampliação de cinco a oito vezes, selecionando folículos de tamanho entre 130 e 150 mícrons que apresentem morfologia saudável, incluindo duas a três camadas de células da granulosa, ausência de separação entre oócito e células da granulosa e oócitos íntegros e arredondados. Transfira os folículos saudáveis para o centro de outra placa de FIV para encapsulação. Para o método de gota de encapsulação folicular, adicione um mililitro de solução de trombina a 50 unidades internacionais por mililitro no poço central de uma placa de FIV, descongele e mantenha a solução estoque de fibrinogênio em gelo.E aqueça o fibrinogênio até a temperatura ambiente imediatamente antes da encapsulação. Prepare a solução de alginato com fibrinogênio misturando PBS 1×, alginato 0,5% e 50 miligramas por mililitro imediatamente antes do uso.Fibrinogênio em uma proporção de dois para um para um em um tubo microcentrífugo estéril de 1,7 mililitro. Vortexe suavemente e centrifugue a solução levemente turva para reduzir a evaporação. Desligue o estágio de aquecimento no microscópio estereoscópico no canto do anel externo de uma placa de FIV coloque.90 microlitros de solução de alginato de fibrinogênio para encapsulação e uma segunda gota de 10 microlitros para um passo de lavagem. Transfira 10 a 15 folículos para a gota de 10 microlitros com uma quantidade mínima de meio de cultura e, rapidamente, misture-os com uma quantidade mínima de solução; em seguida, transfira todos os folículos para a gota de 90 microlitros e misture. Aspire um folículo dentro de cinco microlitros de solução de alginato de fibrinogênio usando uma ponteira de 10 microlitros e libere a solução de alginato de fibrinogênio junto com o folículo na solução de trombina no centro da placa de FIV. Continue repetindo este passo até que todos os folículos sejam encapsulados.Deixe as esferas repousarem por cinco a sete minutos para promover a ligação cruzada do gel na solução de cálcio trombina. As esferas escurecerão à medida que o fibrina for formado. Transfira as esferas para o meio de manutenção, começando pelas esferas mais escuras.Primeiro, incubar por 15 a 30 minutos a 37 graus Celsius e remover o trombina remanescente com enxágue. Por fim, transferir as microesferas para uma placa de cultura e realizar a imagem. Preparar imediatamente a solução de alginato de fibrinogênio misturando alginato 0,5% e 50 miligramas por mililitro.Fibrinogênio na proporção de um para um em um tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 mililitro, pipete gotas de 7,5 microlitros da mistura de fibrinogênio e alginato sobre o vidro revestido com parafina. Deslize com um espaçador de três milímetros e transfira um folículo para cada gota. Com uma quantidade mínima de meio.Adicione 7,5 microlitros de solução de trombina a cada gota sem tocar ou misturar a gota com o folículo, pois o gel se forma quase instantaneamente. Cubra os géis com o segundo vidro revestido com parafina. Deslize e coloque em uma placa de 100 milímetros virada de cabeça para baixo em uma incubadora por cinco minutos.Transfira as microesferas adesivas para o meio de manutenção usando pin&ccedil;as, se necess&aacute;rio, e depois para um po&ccedil;o de cultura a cada dois dias. Imagem os fol&iacute;culos cultivados utilizando um microsc&oacute;pio &oacute;ptico e me&ccedil;a o di&acirc;metro do fol&iacute;culo com o ImageJ. Substitua tamb&eacute;m metade do meio de crescimento por meio de crescimento rec&eacute;m-equilibrado a cada dois dias. Ap&oacute;s oito dias de cultivo, o hidrogel dever&aacute; apresentar-se transparente devido &agrave; degrada&ccedil;&atilde;o completa dos componentes de fibrina, e os fol&iacute;culos podem atingir suas dimens&otilde;es finais superiores a 400 m&iacute;crons de di&acirc;metro. Remova o meio de crescimento e adicione 100 microlitros de 10 unidades internacionais por mililitro.A alginase liga-se na membrana alfa para degradar o alginato. Coloque a placa em uma incubadora por 25 a 30 minutos. Em seguida, remova os folículos das esferas parcialmente dissolvidas com uma ponteira de extremidade romba.Transfira os folículos para o anel externo de uma placa de FIV com meio de dissecação para lavar o alginato, e depois transfira para o anel interno. Agora, transfira os folículos antrais para o anel externo e, em seguida, para o anel interno da placa de FIV com meio de maturação contendo HCG e EGF, e incube em uma incubadora de dióxido de carbono por 15 a 16 horas. Examine as culturas quanto à expansão das células do cumulus para remover as células do cumulus.Adicione a solução IDE mais concentrada até uma concentração final de 0,1 miligrama por mililitro e incube por dois a três minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Pipete com a boca para liberar. Os ovócitos das células do cumulus, finalmente, têm seu estágio de maturação determinado sob o microscópio.O alginato é um biomaterial natural adequado para o cultivo de folículos in vitro devido às suas características biofísicas e bioquímicas suaves, como tamanho da malha, rigidez controlável e inércia biológica. Folículos pequenos encapsulados experimentam baixa força compressiva no alginato no início do cultivo. No entanto, à medida que o folículo se expande, o volume deslocado na esfera aumenta, o que resulta em maior força compressiva na direção oposta à expansão do folículo.As cadeias de polímeros individuais estão completamente entrelaçadas na solução de alginato de fibrilina antes da reticulação. Ambos os componentes do F-A-I-P-N começam a reticular imediatamente ao serem expostos à mistura de trombina e cálcio; os folículos degradam o componente de fibrina do F-A-I-P-N durante o período de cultura, o que é demonstrado por um círculo claro ao redor do folículo. A arquitetura tridimensional do folículo é sustentada pelo alginato remanescente.Essas imagens mostram o crescimento de folículos secundários em F-A-I-P-N ao longo do tempo, do dia 0, 4, 6 e oito até o estágio resultante M dois estágio X. Com corpo polar, uma pronina é um inibidor de protease que pode ser adicionado ao meio de cultura para retardar a degradação do fibrina. Quando 0,01 UI de aprotinina por mililitro é adicionado ao meio de cultura nos primeiros quatro dias, os folículos não são capazes de degradar a matriz. E após a remoção da proteína, os folículos retomam o crescimento e atingem o estágio antral.No entanto, os folículos cultivados inicialmente em uma concentração mais elevada de aprotinina apresentaram crescimento inibido. Hoje demonstramos uma nova técnica para variação do encapsulamento folicular e cultura in vitro em uma rede tridimensional de alginato de fibrina. O sistema não apenas mantém a estrutura intacta do folículo durante a cultura, mas também sustenta com sucesso a gametogênese folicular in vitro, o que resulta em óvulos em estágio MII.Essa tecnologia é importante para descobrir como o folículo ovariano funciona e tem o potencial de oferecer opções de fertilidade a jovens pacientes com câncer. De forma mais geral, este sistema de cultura pode ser usado para o cultivo de aglomerados celulares ou para o cultivo de células enquanto elas se organizam em estruturas. Esses sistemas de cultura 3D fornecerão ferramentas valiosas para a análise molecular do crescimento tecidual.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Cultura de células normais em seu contexto tridimensional representa um método alternativo para estudar os eventos iniciais necessárias para a transformação celular e tumorigênese. Este método é usado para crescer ovariano normal e células oviductal para estudar os eventos iniciais na formação de câncer de ovário.

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Este vídeo descreve os protocolos para encapsular complexos cumulus-oócitos suínos (COCs) em esferas de fibrina-alginato para estabelecer uma cultura 3D. Este sistema de maturação in vitro mantém a comunicação normal célula a célula, garantindo a maturação do oócito e mantendo a viabilidade.

Cultura 3D de COCs suínos: um procedimento para encapsular complexos de oócitos cumulus em esferas de hidrogel de polímero de fibrina-alginato

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para o encapsulamento de oócitos suínos em microbiorreatores hidrofóbicos.

Sistema de Microbiorreator de Mármore Líquido: Um Protocolo de Cultura 3D para Encapsulamento de Oócitos Suínos

Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Apresentados aqui estão dois protocolos para o encapsulamento de oócitos suínos em condições culturais 3D. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte (COCs) são encapsulados em contas fibrina-alginato. No segundo, são fechados com partículas fluoradas de propileno de etileno (microbioreatores). Ambos os sistemas garantem condições ideais para manter sua organização 3D.

Hidrogéis alginatos desordeiros descabidos proteolíticos e microbiorreatores hidrofóbicos para encapsulamento de oócito suíno

Este protocolo descreve um novo modelo de cultura tridimensional (3-D) usando um hidrogel de hialuronano ligado à tiramina para encapsular e cultivar folículos pré-antrais do ovário de camundongo. Também detalhamos duas abordagens para a criopreservação do folículo ovariano por vitrificação.

Aplicação de um novo hidrogel de hialuronano para cultura de folículos tridimensionais e metodologia para criopreservação de folículos ovarianos de camundongos

Descrevemos métodos para cultura de folículos ovarianos em um novo molde de agarose livre de andaimes que complementa a gametogênese in vitro .

Produção e uso de moldes de agarose personalizáveis para cultura de folículos ovarianos de camundongos sem andaimes

Descrevemos métodos para isolar células somáticas ovarianas de camundongos a partir de uma fração rica em estroma do ovário e para gerar organoides somáticos ovarianos de camundongos usando uma abordagem sem andaimes.

Sondando o Microambiente Ovariano: Métodos para Isolamento, Cultura 2D e Cultura Organoide de Células Somáticas Ovarianas de Camundongos

É descrito um método para a preparação de uma matriz de 3-dimensional constituído por colagénio do tipo I e fibroblastos humanos primários. Este gel organotípica serve como um substrato útil para avaliar a migração celular invasiva porque imita características básicas de estroma de tecido e é susceptível de muitas formas de microscopia.

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Aprenda a encapsular folículos ovarianos em rede de fibrina-alginato 3D para cultivo in vitro. Este método mantém a arquitetura folicular e suporta a comunicação celular durante a maturação de oócitos em camundongos.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

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