Name: Placa sólida baseada na restrição dietética Caenorhabditis elegans /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprenda a realizar restrição dietética em placas sólidas com Caenorhabditis elegans usando bactérias mortas. Este método permite estudar longevidade, reprodução e metabolismo em organismos modelo.

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Este trabalho foi financiado por um prêmio de piloto do Centro de Choque Nathan (P30 AG13283) e uma subvenção R01 (R01 AG028516) do Instituto Nacional do Envelhecimento (NIA) para A.-LH

1. Estabelecer uma curva de calibração para a estimativa das concentrações de bactérias Esta seção descreve um método para a estimativa da concentração de bactérias por qualquer estirpe de bactérias dada (por exemplo, OP50, HT115) que será usado como fonte de alimento para os experimentos A restrição alimentar em C. elegans. Curvas de calibração em separado devem ser estabelecidos para cada bactéria cepa utilizada. <ol><li> Inocular uma única colônia de E. coli OP50 bactérias escolhidos de uma raia fresca de bactérias em agar LB em 3 mL de caldo LB líquido. </li><li> Cultura local OP50 em 37 ° C shaker e permitir que as bactérias cresçam durante a noite. </li><li> Prepare serial 2 diluições da suspensão bacteriana a partir da cultura durante a noite (2x, 4x, 8x, 16x, 32x). </li><li> Medir a absorbância (densidade óptica) de cada diluição em 600 nm em espectrofotômetro em triplicado. </li><li> Dilua cada suspensão bacteriana 1000000 vezes (1000 vezes diluição duas vezes). </li><li> Spread 0,4 mL de suspensão bacteriana de cada diluição uniformemente sobre uma placa de agar 100 milímetros LB. </li><li> Coloque placas de LB com OP50 em uma incubadora de 37 ° C por 18-24 horas. </li><li> Contar o número de colônias de bactérias cultivadas em cada prato. A contagem de colônias são usados ​​para calcular ufc (unidades formadoras de colônia) por ml para cada amostra. </li><li> A relação entre a medida OD 600 valores e OP50 concentrações de bactérias pode ser estabelecida através da representação gráfica OD 600 como uma função da concentração de bactérias (UFC / mL) e realizando uma análise de regressão linear (Figura 1). </li></ol> Soluções: <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Luria Broth (LB), 1L: </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> Bacto-triptona </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Extrato de levedura </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr></tbody></table> Adicione água deionizada para 1L. Autoclave e armazenar em temperatura ambiente. 2. Preparação de sólidos placa baseada na dieta de restrição (SDR) placas Esta seção descreve a preparação de placas para uso em chapas sólidas baseada em dieta de restrição (SDR) experimentos. Normalmente, considera-se uma concentração de bactérias de 1 x 10 11 ufc / mL como o ad libitum condição de alimentação e 1 x 10 8 ufc / mL como a condição ideal de alimentação DR para este método. No entanto, 4-6 diferentes concentrações de bactérias pode ser necessário para estabelecer uma relação dose-dependente completa para SDR e suas respostas. <ol><li> Inocular uma única colônia de E. OP50 coli bactéria em 3 mL de caldo LB líquido. </li><li> Coloque a cultura OP50 em 37 ° C shaker e permitir que as bactérias cresçam por 6-8 horas. </li><li> Transferir a cultura OP50 para um balão novo contendo 500 mL de caldo LB, e coloque a cultura OP50 de volta em 37 ° C shaker durante a noite. </li><li> Medir o OD 600 da cultura OP50 para determinar a concentração de bactérias (a concentração é calculado utilizando a curva de calibração gerada em Part 1). Diluições apropriadas podem ser necessários para uma medição precisa da absorbância. </li><li> Pellet OP50 bactérias por centrifugação a 1.500 g por 20 minutos. </li><li> Ressuspender as bactérias a uma concentração de 1 x 10 12 ufc / mL. </li><li> Preparar 10 mL cultura de bactérias em seis diferentes concentrações: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 ufc / mL. </li><li> Pipetar 0,2 mL de cultura de bactérias para o centro de uma placa de 60 mm solidificou NGM. Evite tocar na superfície da placa com a ponta da pipeta, como nicks na superfície permitem worms para penetrar na placas de ágar. </li><li> Placas lugar em 37 ° C incubadora por 1 hora. </li><li> Aplicar 10μL de 100mg/ml carbenicilina e 10 mL de canamicina 50mg/ml a cada placa para prender o crescimento das bactérias. </li><li> Placas de loja com diferentes concentrações de antibióticos de bactérias mortas a 4 ° C para uso futuro (até um mês). É importante preparar e armazenar placas suficiente para todo o experimento planejado pelo menos 1-2 dias adiante. Usando o mesmo lote de placas para todo o experimento é preferível. </li><li> Para verificar a viabilidade das bactérias, raspar algumas bactérias para fora das placas DSE e espalhá-lo em uma placa NGM vazio com carbenicilina e canamicina. Coloque a placa em 37 ° C incubadora de 6-8 horas e em seguida, verificar para o crescimento das bactérias (sem o crescimento de bactérias deve ser observado). </li></ol> Soluções <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nematóide Crescimento Media (NGM), 1L: </td></tr><tr><td> 3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 g </td><td> Bacto-peptona </td></tr><tr><td> 20g </td><td> Agar </td></tr></tbody></table>ove_content "&gt; Autoclave por 40 minutos e deixe esfriar até 65 ° C, em seguida, acrescentar: <table border="1"><tbody><tr><td> 1 mL </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 1 mL </td><td> 1 M CaCl 2 </td></tr><tr><td> 1 mL </td><td> Colesterol 5 mg / mL </td></tr><tr><td> 25 mL </td><td> Fosfato de Potássio 1M, pH 6,0 </td></tr></tbody></table> Imediatamente despeje NGM líquido sobre 60 milímetros x 15 milímetros pratos petri em 10 alíquotas mL 3. Criação de experimentos SDR Para a maioria dos estudos SDR-relacionados, tais como análise de tempo de vida e perfil de fertilidade, a preparação de uma era sincronizada população de vermes é essencial. Para outros estudos, simplesmente transferir worms de uma placa de OP50 regular para uma placa de SDR para iniciar a restrição alimentar. Nesta seção, um protocolo para criar uma análise de ciclo de vida para os animais SDR é descrito como um exemplo. <ol><li> Use um seletor de verme de platina para transferir 20-30 adultos reprodutivamente ativos em várias placas NGM regular com OP50. Dependendo do número de ovos necessários para os experimentos, mais adultos podem ser necessárias. </li><li> Deixar as placas a 20 ° C por 4 horas para permitir a postura de ovos. </li><li> Remove os adultos a partir da placa. As placas devem ser inspeccionados visualmente para os ovos. </li><li> Deixar as placas a 20 ° C e permitir que a progênie de desenvolver na fase adulta Late-L4/day 1. Normalmente, isso leva de 3 dias para worms N2 selvagens tipos a 20 ° C. </li><li> Transferência de um número adequado de adultos dia 1 na placa de SDR para iniciar a restrição alimentar. </li><li> Para uma análise vida, criou um total de 6-8 com 10-20 placas worms por placa para cada condição SDR. </li><li> Pontuação a viabilidade de cada minhoca a cada 2 dias até que todos os vermes já morreram. É fundamental que worms ser transferidos para placas DSE fresco todos os 12-48 horas para evitar a privação completa de alimentos. </li></ol> 4. Resultados representativos: Mostrado na Figura 1 é um gráfico de uma curva de calibração representante para a estimativa das OP50 concentração em relação ao OD 600. A equação gerada pela análise de regressão liner pode ser usado para todos os cálculos futuro da OP50 concentrações de bactérias. Mostrado na Figura 2 é um exemplo de doseamento do efeito dos tratamentos SDR crônica na vida útil média de cepas de vírus diferentes. A linha azul representa uma resposta dose-dependente normal de tipo selvagem worms para SDR. A linha vermelha indica que o efeito tempo de vida de SDR é parcialmente suprimida pela DRR-2 oe, enquanto daf-16 (mu86) não tem efeito sobre SDR-induzida extensão vida. Método de detalhes para a realização de análise de ciclo de vida em C. elegans é descrita na literatura anterior 1-3. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Resultado Representante de uma curva de calibração para a estimativa de E. Concentração de Escherichia OP50. OP50 concentração é plotado como uma função da medida OD 600 valores. Barras de erro = SD cultura Overnight bacteriana foi diluída 8x 1.5x, 2x, 4x, 16x, 32x antes da medição de absorbância, e posteriormente diluído 1.000 x duas vezes antes da medição ufc. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representante resultado de um C. elegans experimento vida comparando animais tipo selvagem N2 (azul) com dois mutantes diferentes (verde e vermelho) em resposta a SDR (Figura de Ching et al. 4). Barras de erro = SEM

<ol><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li>
<li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li>
<li>Weindruch, R., Walford, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeindruch%2C+R+%22The+Retardation+of+Aging+and+Disease+by+Dietary+Restriction%22">The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction</a>. , Thomas. (1988).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield+history%3A+caloric+restriction%2C+slowing+aging%2C+and+extending+life%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+caloric+restriction+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Overview of caloric restriction and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+growth+up-regulates+mass-specific+metabolic+rate%2C+stress+resistance%2C+and+extends+life+span+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Bishop, N. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+neurons+mediate+diet-restriction-induced+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans.</a> Nature. 447, 545-549 (2007).</li>
<li>Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHA-4%2FFoxa+mediates+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Nature. 447, 550-555 (2007).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li>
<li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li>
<li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Restrição dietética (DR) é conhecido por aumentar a longevidade ea retardar o aparecimento de várias doenças relacionadas à idade em uma ampla gama de espécies, incluindo mamíferos 5-7. Manipulações ambientais e genéticos têm sido usados ​​para modelar DR em C. elegans, incluindo worms cultura em um meio semi-definido líquido 8,9, diluição da fonte de alimento de bactérias em meio líquido 10-12, e uso de mutantes comportamento que se alimentam em um ritmo mais lento 13.</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Carbenicilina </td><td> Duchefa Biochemie </td><td> C0109.25 </td><td> Dissolvido em água. </td></tr><tr><td> Canamicina </td><td> Roche </td><td> 10106801001 </td><td> Dissolvido em água. </td></tr><tr><td> Bacto-peptona </td><td> Becton, Dickinson e companhia </td><td> DF0118072 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-triptona </td><td> Becton, Dickinson e companhia </td><td> DF0123075 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto levedura-extrato de </td><td> Becton, Dickinson e companhia </td><td> DF0127071 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Becton, Dickinson e companhia </td><td> DF00145170 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de cultura estéril </td><td> EUA Scientific </td><td> 1485-0810 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Amersham Biosciences </td><td> Gene Quant pro </td><td> Amersham agora faz parte da GE Healthcare. </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação </td><td> Zeiss </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Beckman Coulter </td><td> Accuspin FR </td><td></td></tr></tbody></table>

placa sólida baseada na restrição dietética caenorhabditis elegans</em

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Redução da ingestão alimentar sem desnutrição ou fome é conhecido por aumentar a longevidade ea retardar o aparecimento de várias doenças relacionadas à idade em uma ampla gama de espécies, incluindo mamíferos. Ela também provoca uma diminuição no peso corporal e fertilidade, bem como níveis mais baixos de glicose plasmática, insulina e IGF-1 nesses animais. Este tratamento é muitas vezes referida como restrição dietética (DR) ou a restrição calórica (CR). O nemátodo Caenorhabditis elegans tem emergido como um organismo modelo importante para o estudo da biologia do envelhecimento. Manipulações ambientais e genéticos têm sido usados ​​para modelar DR e têm mostrado que prolonga a vida em C. elegans. No entanto, muitos dos estudos relatados DR em C. elegans foram feitas por animais propagação em meios líquidos, enquanto a maioria dos estudos genéticos na área do envelhecimento foram feitos no ágar padrão sólido em placas de petri. Aqui apresentamos um protocolo DR usando o padrão sólido NGM placa de ágar-base com as bactérias mortas.

Aqui apresentamos um protocolo para a realização de restrição placa baseada em sólidos na dieta<em&gt; C. elegans</em&gt; Com bactérias mortas.

Placa sólida baseada na restrição dietética Caenorhabditis elegans</em

Sabe-se que a redução da ingestão alimentar sem desnutrição ou inanição aumenta a longevidade e retarda o surgimento de diversas doenças relacionadas à idade em uma ampla...

O procedimento realiza restrição dietética no meio padrão baseado em ágar em *Caenorhabditis elegans* para estudar seus efeitos sobre longevidade, reprodução e metabolismo. Isso é realizado primeiramente medindo com precisão a concentração das bactérias que serão utilizadas como fonte alimentar. O segundo passo do procedimento consiste em diluir adequadamente a cultura bacteriana em concentrações apropriadas.Em seguida, prepare placas SDR com bactérias mortas. Finalmente, monte experimentos SDR com uma população de vermes sincronizada por idade. Os resultados das medições de produção de prole e longevidade podem mostrar uma produção de prole retardada e reduzida, bem como um aumento na longevidade média.A principal vantagem desta técnica em relação a 60 métodos como o Dian em meio AZA é que todo o experimento será realizado em uma placa sólida padrão baseada em AGA, utilizada pela maioria dos laboratórios com organismos termófilos para experimentos de restrição dietética, e é necessário estabelecer curvas de calibração separadas para cada linhagem bacteriana usada como fonte alimentar. Escolha uma única colônia da bactéria Escherichia coli OP50 a partir de um streak fresco em ágar LB e inocule três mililitros de cultura líquida em caldo LB em um agitador a 37 graus Celsius durante a noite. Prepare diluições seriadas de duas vezes da cultura noturna.Em seguida, meça a absorbância de cada diluição a 600 nanômetros por espectrofotômetro em triplicata. Dilua ainda mais cada suspensão bacteriana, diluindo uniformemente 0,4 mililitros da suspensão bacteriana de cada diluição em uma placa de ágar LB de 100 milímetros e incube a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas. Conte o número de colônias bacterianas desenvolvidas em cada placa para calcular as unidades formadoras de colônias por mililitro para cada amostra.Agora, plote a DO 600 em função da concentração bacteriana e realize uma análise de regressão linear para estabelecer a relação entre os valores medidos de DO 600 e as concentrações de bactérias OP 50. Para este método, utiliza-se uma concentração bacteriana de um vezes 10 à 11ª UFC por mililitro na condição de alimentação ad libitum e um vezes 10 à 8ª UFC por mililitro como condição ótima de DR. No entanto, podem ser necessárias quatro a seis concentrações bacterianas diferentes para estabelecer uma relação completa dependente da dose.Para SDR e suas respostas. Prepare um inóculo com uma única colônia de bactéria Escherichia coli OP50 em três mililitros de caldo LB líquido, cultivados em agitador a 37 °C por seis a oito horas. Transfira a cultura OP50 para um novo frasco contendo 500 mililitros de caldo LB e cultive durante a noite para que as bactérias atinjam a saturação, se necessário.Prepare a diluição apropriada da cultura OP 50 para a medição da absorbância em OD 600. Para determinar a concentração bacteriana, pelletize as bactérias por centrifugação a 1500 Gs durante 20 minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda as bactérias em uma concentração de um vezes 10 à 12ª UFCs por mililitro.Agora, prepare culturas bacterianas de 10 mililitros em seis concentrações diferentes, variando de um vezes 10 à 12ª até um vezes 10 à 7ª UFC por mililitro. Pipete 0,2 mililitro da cultura bacteriana no centro de uma placa N GM solidificada de 60 milímetros. Evite tocar a superfície da placa com a ponteira da pipeta, pois arranhões na superfície permitem que os vermes se enterrem nos aerotaxis.Coloque as placas em um incubador a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 10 microlitros de 100 miligramas por mililitro de carbonato sódico e 10 microlitros de 50 miligramas por mililitro de canamicina a cada placa para inibir o crescimento das bactérias. Armazene as placas com diferentes concentrações de antibiótico que mataram as bactérias a quatro graus Celsius para uso futuro por até um mês.É importante preparar e armazenar placas suficientes, preferencialmente do mesmo lote para toda a planta. Realize um experimento de um a dois dias antes para verificar a viabilidade das bactérias. Raspe algumas bactérias das placas SDR e espalhe sobre uma placa N GM vazia com carbônico, sein e antimicina.Coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius por seis a oito horas e confirme a ausência de crescimento bacteriano. Para a maioria dos estudos relacionados à SDR, como análise de longevidade e perfilagem da produção de prole, a preparação de uma população de vermes sincronizada por idade é essencial. Use um coletor de vermes de platina para transferir 20 a 30 adultos reprodutivamente ativos para várias placas NGM comuns.Com OP 50. Dependendo do número de ovos necessários para os experimentos, pode ser necessário um maior número de adultos. Incube as placas a 20 graus Celsius por quatro horas para permitir a postura de ovos.Remova os adultos da placa e inspecione visualmente as placas em busca de ovos. Continue a incubar as placas a 20 graus Celsius para permitir que a prole se desenvolva até o estágio adulto tardio L4/dia um. Normalmente, isso leva três dias para vermes selvagens N2 a 20 graus Celsius.Para análise de longevidade. Transfira 10 a 12 vermes adultos do dia um para uma placa SDR para iniciar a restrição dietética. Para obter poder estatístico suficiente, utilize um total de 60 a 100 vermes para cada condição de SDR.Avalie a viabilidade de cada verme a cada dois ou três dias até que todos os vermes tenham morrido. Importante: transfira os vermes para placas SDR frescas a cada dois dias para evitar a inanição. Esta curva de calibração mostra a concentração de OP50 em relação à DO600.A equação gerada pela análise de regressão linear pode ser usada para todos os cálculos futuros das concentrações bacterianas OP 50. Este estudo analisa o efeito de tratamentos crônicos com SDR sobre a longevidade média de diferentes linhagens de vermes, em comparação com a resposta dependente da dose normal de vermes selvagens ao SDR. O efeito do SDR sobre a longevidade é parcialmente suprimido pela superexpressão de DR dois, enquanto a mutação DAF 16 MU 86 não tem efeito sobre a extensão da longevidade induzida por SDR.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o Dian na jogada padrão baseada em AGA na elegância marinha.

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A facilidade de manutenção e propagação do...

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; é um modelo útil para explorar as funções de ácidos graxos poliinsaturados em desenvolvimento e fisiologia. Este protocolo descreve um método eficiente de complementar o &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; dieta com ácidos graxos poliinsaturados.

A suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Este protocolo descreve como as células em divisão imagem dentro de um tecido em Caenorhabditis elegans embriões. Embora vários protocolos descrevem como a divisão celular imagem no embrião precoce, este protocolo descreve como imagem divisão celular dentro de um tecido em desenvolvimento em meados embriogénese tardia.

Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogênese

Aqui, apresentamos um ensaio específico de Caenorhabditis elegans projetado para avaliar mudanças no comportamento de aversão ao cobre e a capacidade de localizar uma fonte de alimento comum, à medida que o organismo progride de um estado nutricional bem alimentado para morrer de fome.

UMA<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional

Aqui, apresentamos um quadro para relacionar a restrição dietética de vasta gama de expectativa de vida e expressão gênica. Descrevemos os protocolos para a vasta gama de restrição dietética e para a imagem latente quantitativa da expressão do gene sob esse paradigma. Nós esboçamos mais análises computacionais para revelar subjacentes recursos de processamento de informações dos circuitos genéticos envolveram na detecção comida.

Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans.

Este protocolo demonstra como controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor, usando uma fluorescência verde (GFP) de proteína proteína da fusão como um marcador e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração. O DAPI protocolo de coloração é rápido e preserva os sinais de Localização subcellular GFP e proteína.

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

O protocolo a seguir descreve o desenvolvimento e otimização de um fluxo de trabalho de alto rendimento para cultivo de vermes, imagens de fluorescência e processamento automatizado de imagens para quantificar agregados de poliglutamina como uma avaliação de mudanças na proteostase.

Automatizando quantificação agregada em caenorhabditis elegans

Este é um método comumente usado para a dissecção de gônadas de C. elegans seguida de quebra por congelamento, que produz amostras da linha germinativa para imunofluorescência via coloração de anticorpos ou para coloração DAPI simples para visualizar o DNA. Este protocolo tem sido bem sucedido para estudantes de graduação em um laboratório de pesquisa e em uma experiência de pesquisa de graduação baseada em curso.

C. elegans Dissecção de Gônadas e Congelamento de Fissuras para Imunofluorescência e Coloração DAPI

Este protocolo descreve um ensaio para quantificar a taxa de alimentação de Caenorhabditis elegans com base na medição da depuração de bactérias em cultura líquida.

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Aprenda a realizar restrição dietética em placas sólidas com Caenorhabditis elegans usando bactérias mortas. Este método permite estudar longevidade, reprodução e metabolismo em organismos modelo.

Placa sólida baseada na restrição dietética Caenorhabditis elegans

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