Placa sólida baseada na restrição dietética Caenorhabditis elegans

O procedimento realiza restrição dietética na placa degradada padrão na elegância do mar para estudar seu efeito na longevidade, reprodução e metabolismo. Isso é feito medindo primeiro com precisão a concentração das bactérias que serão usadas como fonte de alimento. A segunda etapa do procedimento é diluir adequadamente a cultura de bactérias em concentrações adequadas.

Em seguida, prepare placas SDR degradadas com bactérias mortas. Finalmente, configure experimentos SDR com uma população de vermes sincronizada com a idade. Os resultados das medições de produção e vida útil da progênie podem mostrar produção de progênie atrasada e reduzida, bem como aumento da expectativa de vida média.

A principal vantagem desta técnica em relação a 60 métodos como Dian em meio AZA, é que todo o experimento será feito em um jogo baseado em AGA sólido padrão que é usado pela maioria dos laboratórios quentes Para experimentos de restrição dietética e ver elegância estabelecer curvas de calibração separadas para cada cepa de bactéria usada como fonte de alimento. Escolha uma única colônia de bactérias e coli OP 50 de uma faixa fresca em ágar lb e inocule três mililitros de cultura de caldo lb líquido em um shaker de 37 graus Celsius durante a noite. Preparar a diluição dupla em série da cultura durante a noite.

Em seguida, medir a absorvência de cada diluição a 600 nanómetros por espectrofotómetro em triplicado. Além disso, em cada suspensão bacteriana, 1 milhão de vezes semeia uniformemente 0,4 mililitros de suspensão bacteriana de cada diluição em uma placa agrícola de 100 milímetros de libra e incuba a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas. Conte o número de colônias bacterianas cultivadas em cada placa para calcular as unidades formadoras de colônias por mililitro para cada amostra.

Agora plote OD 600 em função da concentração bacteriana e execute uma análise de regressão linear para estabelecer a relação entre os valores medidos de OD 600 e as concentrações de bactérias OP 50. Para este método, uma concentração de bactérias de uma vez 10 elevado a 11 UFC por mililitro é usada na condição de alimentação ad lido e uma vez 10 elevado a oitavo UFC por mililitro como a condição ideal de alimentação DR. No entanto, quatro a seis concentrações diferentes de bactérias podem ser necessárias para estabelecer uma relação dose-dependente completa.

Para SDR e suas respostas. Prepare um inóculo com uma única colônia de bactérias e coli OP 50 em três mililitros de caldo LB líquido, cultivado em um shaker a 37 graus Celsius por seis a oito horas. Transfira a cultura OP 50 para um novo frasco contendo 500 mililitros de caldo LB e cresça durante a noite para que as bactérias atinjam a saturação, se necessário.

Preparar a diluição adequada da cultura OP 50 para a medição da absorvência a OD 600. Para determinar a concentração de bactérias, pulverizar as bactérias por centrifugação a 1500 Gs por 20 minutos. Remover o sobrenadante e ressuspender as bactérias a uma concentração de uma vez 10 em um dos 12º UFC por mililitro.

Agora, prepare culturas de bactérias de 10 mililitros em seis concentrações diferentes, variando de uma vez 10 do 12º a uma vez 10 da sétima UFC por mililitro de pipeta. Aponte dois mililitros de cultura de bactérias no centro de uma placa N GM solidificada de 60 milímetros. Evite tocar na superfície da placa com a ponta da pipeta, pois cortes na superfície permitem que os vermes penetrem nos aeradores.

Coloque as placas em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, aplique 10 microlitros de 100 miligramas por mililitro de soína carbônica e 10 microlitros de 50 miligramas por mililitro de lata de micina em cada placa para um crescimento residual da bactéria. Armazene pratos com diferentes concentrações de bactérias mortas por antibióticos a quatro graus Celsius para uso futuro por até um mês.

É importante preparar e armazenar placas suficientes, de preferência o mesmo lote para toda a planta. Experimente pelo menos um a dois dias antes para verificar a viabilidade da bactéria. Raspe algumas bactérias das placas SDR e espalhe-as em uma placa N GM vazia com carbono, seína e antimicina.

Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por seis a oito horas e confirme a ausência de crescimento bacteriano. Para a maioria dos estudos relacionados ao SDR, como análise de expectativa de vida e perfil de produção de progênies, a preparação de uma população de vermes sincronizada com a idade é essencial. Use um seletor de minhoca de platina para transferir de 20 a 30 adultos reprodutivamente ativos para várias placas NGM regulares.

Com OP 50. Dependendo do número de ovos necessários para os experimentos, mais adultos podem ser necessários. Deixe os pratos a 20 graus Celsius por quatro horas para permitir a postura dos ovos.

Remova os adultos do prato e inspecione visualmente os pratos em busca de ovos. Continue a incubar as placas a 20 graus Celsius para permitir que a progênie se desenvolva no final do estágio adulto de quatro dias. Normalmente, isso leva três dias para N dois vermes do tipo selvagem a 20 graus Celsius.

Para análise de vida útil. Transfira vermes adultos de 10 a 12 dias para uma placa SDR para iniciar a restrição alimentar. Para obter poder estatístico suficiente, use um total de 60 a 100 worms para cada condição SDR.

Marque a viabilidade de cada verme a cada dois ou três dias até que todos os vermes tenham morrido. É importante ressaltar que transfira os vermes para placas SDR frescas a cada dois dias para evitar a fome. Esta curva de calibração representa graficamente a concentração OP 50 em relação ao OD 600.

A equação gerada pela análise de regressão linear pode ser usada para todos os cálculos futuros das concentrações de bactérias OP 50. Este estudo analisa o efeito dos tratamentos crônicos de SDR na vida útil média de diferentes cepas de vermes em comparação com uma resposta dependente da dose normal de vermes do tipo selvagem ao SDR. O efeito de vida útil do SDR é parcialmente suprimido pela superexpressão de DR dois, enquanto a mutação DAF 16 MU 86 não tem efeito na extensão da vida útil induzida por SDR.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como executar Dian no jogo padrão baseado em AGA na elegância do mar.