Sete Passos para Stellate Células

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células estreladas hepáticas do fígado de camundongo. Isso é feito realizando primeiro em C duas perfusões de fígados de camundongos com enzimas digestivas. Após a perfusão, os fígados são cortados em pequenos pedaços para aumentar a eficiência da digestão in vitro, que é realizada em seguida.

Como etapa final, as células estreladas hepáticas são separadas de outros tipos de células hepáticas por centrifugação com gradiente de densidade. Por fim, as células estreladas hepáticas são obtidas e sua pureza pode ser avaliada por microscopia de luz e imunofluorescência Demonstrando o procedimento estará Patrick Meyer, um estudante de pós-graduação de um laboratório. Em preparação para o NC, duas perfusões de fígados de camundongos primeiro aquecem as soluções de tampão SC e perfusão enzimática em banho-maria a 37 graus Celsius.

Em seguida, configure a bomba peristáltica para obter um fluxo laminar de 6,5 mililitros por minuto e equilibre o tubo de silicone da bomba com uma solução SC. Agora confirme por uma perda de reflexos que o camundongo anestesiado está profundamente sedado. Em seguida, fixe o mouse em decúbito dorsal em uma base adequada.

Use tesouras e pinças para realizar uma incisão longitudinal na pele abdominal e expor o peritônio. Abra cuidadosamente o peritônio e mova os intestinos para fora da cavidade abdominal para o lado esquerdo do animal, a fim de expor a veia porta. O aspecto mais difícil deste procedimento é a zeto perfusão dos fígados com enzimas digestivas, que será demonstrada.

Em seguida, é importante usar um microscópio estéreo ao inserir a cânula e monitorar de perto a mudança nas estruturas hepáticas durante a perfusão Ao trabalhar sob um microscópio estéreo, insira a cânula do conjunto de infusão na veia porta. Inicie a perfusão do fígado com 30 mililitros de SC uma solução. Abra o Vanna Cava inferior imediatamente após iniciar o fluxo.

A lavagem bem-sucedida do fígado é indicada por uma perda de cor do tecido hepático em seguida, examine o fígado com 30 mililitros de solução de Pronase E. Os lobos do fígado incharão e os lóbulos parecerão distintos através da cápsula após a profusão com solução de pronase E perfundida com 30 mililitros de solução de colagenase P. Quando a profusão com colagenase P estiver completa, colha o fígado do camundongo dissecando-o cuidadosamente do diafragma e dos órgãos circundantes e armazenando-o em 70 mililitros de solução SC dois em gelo.

O fígado neste ponto perdeu sua forma e parece atônico e amorfo. O procedimento de digestão de fígados de camundongos deve ser realizado em condições estéreis. Em uma capela de fluxo laminar.

Use uma tesoura afiada para cortar os fígados em pedaços de aproximadamente dois por dois por dois milímetros cúbicos. Em seguida, combine a suspensão de 70 mililitros de SC dois e os pedaços de fígado com 50 mililitros de solução de protease E colagenase P. Adicione um mililitro de dna, uma solução e digere os fígados por 20 minutos a 37 graus Celsius enquanto mexe.

Após a digestão enzimática do tecido hepático, as células estreladas são separadas de outros tipos de células hepáticas por centrifugação por gradiente de densidade. Para iniciar este procedimento, filtre a suspensão celular através de filtros de células de 70 micrômetros em seis tubos de falcão de 50 mililitros e lave as células com uma centrífuga tampão E two por 10 minutos a 600 Gs e quatro graus Celsius. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente 40 mililitros do sobrenadante de cada tubo.

Em seguida, adicione 150 microlitros de DNA, uma solução para cada tubo e ressuspenda as células. Agrupe as suspensões celulares em quatro tubos Falcon de 50 mililitros e lave com centrífuga G-B-S-S-P por 10 minutos a 600 Gs e quatro graus Celsius. Aspire cuidadosamente o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione 150 microlitros de DNAs, uma solução a cada tubo.

Suspendemos os pellets celulares em 10 mililitros de G-B-S-S-B por tubo. Agrupe as células em dois tubos de falcão de 50 mililitros e adicione G-B-S-S-B a um volume total de 36 mililitros por tubo. Adicione 14 mililitros de solução den a cada tubo e misture bem.

Em seguida, transfira 10 mililitros da suspensão celular para um tubo de centrifugação com gradiente de 12 mililitros, resultando em um total de 10 tubos. Cubra suavemente a suspensão celular com 1,5 mililitros de G-B-S-S-B por tubo. Centrifugue os gradientes por 15 minutos a 1500 Gs e quatro graus Celsius sem interrupção.

Posteriormente, os hepatócitos serão peletizados no fundo do tubo, enquanto as células estreladas são encontradas na interface como um anel branco. Usando uma pipeta de cinco mililitros, colha cuidadosamente a interface que contém as células estreladas e transfira para um tubo de 50 mililitros. Lave as células adicionando G-B-S-S-B e centrifusão por 10 minutos a 600 Gs e quatro graus Celsius.

Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 20 mililitros de DMEM com suplementos. Depois de contar as células, transfira-as para frascos de cultura de tecidos a uma concentração de duas vezes 10 das células do quarto por centímetro quadrado incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Aproximadamente duas horas após a preparação, as células estreladas hepáticas devem estar aderentes, trocar o meio para lavar as células mortas e os detritos celulares.

Devolva as células à incubadora Os resultados representativos da preparação de células estreladas hepáticas de fígados de camundongos usando este protocolo são mostrados aqui. As células do primeiro e terceiro dia de cultura in vitro mostram a morfologia característica das células estreladas hepáticas. Eles têm a forma de líquen astro e exibem armazenamento de vesículas lipídicas.

Em locais por núcleo, a pureza das células estreladas hepáticas isoladas também pode ser verificada pela expressão da proteína ácida fibrilar glial ou GFAP. Essas imagens mostram uma coloração imunofluorescente representativa para GFAP mostrada em vermelho em células estreladas hepáticas, que foram cultivadas por três dias após o isolamento celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células estreladas hepáticas do fígado de neurônios para um rendimento adequado de células estreladas puras.

É importante garantir uma digestão eficiente após a perfusão hepática. Finalmente, é vital determinar a entidade adequada das células isoladas, avaliando a morfologia e o fenótipo das células hepáticas dal.