Sete Passos para Stellate Células
10 de maio de 2011
Aqui nós descrevemos um método para o isolamento de células estreladas hepáticas do fígado do rato. Para a purificação de células estreladas, fígado de camundongos são digeridos In situ E In vitro Por pronase colagenase-tratamento antes da centrifugação em gradiente de densidade. Esta técnica produz células estreladas hepáticas de alta pureza.
O objetivo geral deste procedimento é isolar células estreladas hepáticas do fígado de camundongo. Isso é realizado primeiramente por meio da perfusão in situ do fígado de camundongos com enzimas digestivas. Após a perfusão, os fígados são cortados em pequenos pedaços para aumentar a eficiência da digestão in vitro, que é realizada em seguida.
Como etapa final, as células estreladas hepáticas são separadas de outros tipos celulares hepáticos por centrifugação em gradiente de densidade. Em última instância, as células estreladas hepáticas são obtidas e sua pureza pode ser avaliada por microscopia de luz e imunofluorescência. O procedimento será demonstrado por Patrick Meyer, um estudante de pós-graduação de um laboratório. Em preparação para a perfusão NC dois de fígados de camundongo, aqueça primeiro as soluções de buffer SC um e de enzima em banho-maria a 37 graus Celsius.
Em seguida, prepare a bomba peristáltica para obter um fluxo laminar de 6,5 mililitros por minuto e equilibre o tubo de silicone da bomba com a solução SC um. Agora, confirme por meio da perda de reflexos que o camundongo anestesiado está profundamente sedado. Em seguida, fixe o camundongo em posição supina sobre uma base apropriada.
Use uma tesoura e uma pinça para realizar uma incisão longitudinal na pele abdominal e expor o peritônio. Abra cuidadosamente o peritônio e desloque os intestinos para fora da cavidade abdominal, posicionando-os no lado esquerdo do animal, a fim de expor a veia porta. O aspecto mais difícil deste procedimento é a perfusão zeto dos fígados com enzimas digestivas, a qual será demonstrada.
Em seguida, é importante utilizar um microscópio estereoscópico ao inserir a cânula e monitorar atentamente a alteração nas estruturas do fígado durante a perfusão. Trabalhando sob um microscópio estereoscópico, insira a cânula do conjunto de infusão na veia porta. Inicie a perfusão do fígado com 30 mililitros da solução SC um. Abra imediatamente a veia cava inferior logo após iniciar o fluxo.
O sucesso da lavagem do fígado é indicado pela perda de cor do tecido hepático. Em seguida, examine o fígado com 30 mililitros de solução de Pronase E. Os lobos hepáticos incharão e os lóbulos aparecerão distintos através da cápsula após a perfusão com solução de colagenase P perfundida com 30 mililitros de solução de colagenase P. Quando a perfusão com colagenase P estiver completa, colete o fígado do camundongo dissecando-o cuidadosamente do diafragma e dos órgãos adjacentes e armazene-o em 70 mililitros de solução SC dois em gelo.
O fígado nesse momento perdeu sua forma e apresenta-se atônico e amorfo. O procedimento para a digestão de fígados de camundongo deve ser realizado em condições estéreis. Em uma cabine de fluxo laminar.
Use uma tesoura afiada para cortar os fígados em pedaços de aproximadamente dois por dois por dois milímetros cúbicos. Em seguida, combine a suspensão de 70 mililitros de SC dois e os pedaços de fígado com 50 mililitros de solução de protease E colagenase P. Adicione um mililitro de dna, uma solução, e digira os fígados por 20 minutos a 37 graus Celsius sob agitação.
Após a digestão enzimática do tecido hepático, as células estreladas são separadas dos outros tipos de células hepáticas por centrifugação em gradiente de densidade. Para iniciar este procedimento, filtre a suspensão celular através de peneiras celulares de 70 micrômetros em seis tubos cónicos de 50 mililitros e lave as células com tampão E dois, centrifugando por 10 minutos a 600 Gs e quatro graus Celsius. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente 40 mililitros do sobrenadante de cada tubo.
Em seguida, adicione 150 microlitros da solução de DNA, uma solução para cada tubo, e ressuspenda as células. Reúna as suspensões celulares em quatro tubos Falcon de 50 mililitros e lave com centrífuga G-B-S-S-P por 10 minutos a 600 Gs e 4 graus Celsius. Aspire cuidadosamente o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione 150 microlitros da solução de DNA, uma solução para cada tubo.
Suspendemos os pellets celulares em 10 mililitros de G-B-S-S-B por tubo. Reúna as células em dois tubos cónicos de 50 mililitros e adicione G-B-S-S-B até um volume total de 36 mililitros por tubo. Adicione 14 mililitros de solução den a cada tubo e misture bem.
Em seguida, transfira 10 mililitros da suspensão celular para um tubo de centrifugação em gradiente de 12 mililitros, resultando em um total de 10 tubos. Sobreponha suavemente a suspensão celular com 1,5 mililitro de G-B-S-S-B por tubo. Centrifugue os gradientes por 15 minutos a 1500 Gs e quatro graus Celsius sem freio.
Posteriormente, os hepatócitos serão sedimentados no fundo do tubo, enquanto as células estreladas serão encontradas na interface como um anel branco. Utilizando uma pipeta de cinco mililitros, colete cuidadosamente a interface contendo as células estreladas e transfira para um tubo de 50 mililitros. Lave as células adicionando G-B-S-S-B e centrifugando por 10 minutos a 600 Gs e quatro graus Celsius.
Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 20 mililitros de DMEM com suplementos. Após a contagem das células, transfira-as para frascos de cultura celular numa concentração de dois vezes 10 à quarta células por centímetro quadrado e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Aproximadamente duas horas após a sua preparação, as células estreladas hepáticas devem estar aderidas; troque o meio para remover células mortas e debris celulares.
Retorne as células para o incubador. Os resultados representativos do preparo de células estreladas hepáticas a partir de fígados de camundongos utilizando este protocolo são mostrados aqui. Células no primeiro e no terceiro dia de cultura in vitro exibem a morfologia característica das células estreladas hepáticas. Elas têm formato astro-like e apresentam armazenamento de vesículas lipídicas.
Em locais perinucleares, a pureza das células estreladas hepáticas isoladas também pode ser verificada pela expressão da proteína ácida fibrilar glial ou GFAP. Essas imagens mostram uma coloração imunofluorescente representativa para GFAP, mostrada em vermelho nas células estreladas hepáticas, que foram cultivadas por três dias após o isolamento celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células estreladas hepáticas de fígado normal para obter um rendimento adequado de células estreladas puras.
É importante garantir uma digestão eficiente durante a perfusão hepática. Por fim, é essencial determinar a integridade adequada das células isoladas mediante a avaliação da morfologia e do fenótipo das células hepáticas.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para o isolamento de células estreladas hepáticas do fígado de camundongo. O processo envolve perfusão com enzimas digestivas, seguida por digestão in vitro e centrifugação em gradiente de densidade para obter alta pureza das células.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Pesquisa hepática
- Isolamento de células-tronco
Antecedentes
- As células estreladas hepáticas desempenham um papel crucial na fisiologia hepática.
- O isolamento dessas células é essencial para diversas aplicações de pesquisa.
- Métodos tradicionais podem resultar em populações celulares impuras.
- Este método tem como objetivo melhorar a pureza das células isoladas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o isolamento de células estreladas hepáticas.
- Aumentar a pureza das células isoladas para fins de pesquisa.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Perfusão de fígados de camundongo com enzimas digestivas.
- Digestão in vitro de tecido hepático.
- Centrifugação em gradiente de densidade para separação celular.
- Avaliação da pureza celular utilizando técnicas de microscopia.
Resultados Principais
- Obteve-se alta pureza de células estreladas hepáticas.
- O método permite a separação eficaz de outros tipos celulares hepáticos.
- A pureza celular pode ser avaliada utilizando microscopia de luz e imunofluorescência.
- O protocolo é reprodutível e pode ser utilizado por outros pesquisadores.
Conclusões
- O método descrito é eficiente para o isolamento de células estreladas hepáticas.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa hepática.
- Estudos futuros podem se basear nesta técnica para diversas aplicações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de células estreladas hepáticas permite a desmistificação mecanicista na pesquisa de fibrose hepática e imunometabolismo, fornecendo um sistema purificado e relevante para a doença, útil na validação de alvos. O método auxilia no desenvolvimento de modelos pré-clínicos e na padronização de ensaios, melhorando a confiabilidade preditiva na triagem terapêutica. Este fluxo de trabalho posiciona o preparo de células estreladas como uma etapa fundamental para a descoberta translacional de biomarcadores e a investigação de vias em descoberta de fármacos voltada à hepatologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias mediadas por células estreladas envolvidas na fibrose e suas funções apresentadoras de antígenos para testes de hipóteses direcionadas.
- Valor Operacional: Fornece uma população celular homogênea para reduzir a variabilidade em estudos iniciais de engajamento de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera células estreladas com morfologia de gotículas lipídicas preservada e expressão de GFAP para leituras funcionais em ensaios.
- Valor Operacional: Fornece preparações celulares reprodutíveis adequadas para triagem de alto conteúdo e perfilhamento de bibliotecas de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem relevante para doenças de fibrose hepática e modulação imunológica na validação pré-clínica.
- Valor Operacional: Permite a produção escalável de células estreladas para estudos longitudinais de farmacocinética e farmacodinâmica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho iniciais de descoberta ao fornecer células estreladas validadas para validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e desvio de riscos mecanicistas antes da identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Facilita a elucidação de vias e a validação funcional de alvos por meio do isolamento de células estreladas purificadas.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de suspensões celulares padronizadas e puras para testes de compostos.
- Análises: Apoia a avaliação quantitativa da pureza celular e dos estados de ativação utilizando coloração para GFAP e imagem de gotículas lipídicas.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica à continuidade pré-clínica por meio de modelos de fibrose e interações imunológicas mediadas por células estreladas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de isolamento reutilizável para programas de descoberta focados em hepatologia em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da heterogeneidade celular em estudos de células estreladas.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade do isolamento de células estreladas, permitindo consistência entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de avançar ou interromper projetos ao reduzir riscos em alvos de fibrose e imunologia no início da fase de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de terapêuticos direcionados ao fígado com base em dados mecanicistas de células estreladas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de perfusão, digestão enzimática e centrifugação em gradiente de densidade.
- Depende do acesso a equipamentos de perfusão, filtros para células, centrífugas e preparação de gradiente de Nycodenz.
- Necessita padronização das concentrações de enzimas, tempos de digestão e parâmetros de centrifugação entre as equipes.
- As considerações para adaptação incluem taxas de perfusão específicas da espécie e potência da colagenase para modelos não murinos.
- As limitações práticas incluem a duração do fluxo de trabalho multifásico e a sensibilidade à superdigestão enzimática, que afeta o rendimento e a viabilidade celular.
