Name: Sete Passos para Stellate Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a isolar células estreladas hepáticas de fígado de camundongo usando perfusão enzimática e centrifugação em gradiente de densidade. Este método garante alta pureza celular para pesquisas em biologia hepática.

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Este trabalho foi financiado pelo Prêmio família Smith de Excelência em Pesquisa Biomédica e RO1 AI083426 NIH-01 (FW). Patrick Maschmeyer e Melanie Flach são apoiados por bolsas de doutoramento da Boehringer Ingelheim Foundation.

Camundongos C57BL / 6 deve ser usado em ~ 20 semanas de idade ou mais. O uso de camundongos machos pesando 25-30g é recomendado. O rendimento das células estreladas pode ser aumentado pela alimentação camundongos uma vitamina Uma dieta enriquecida por 2 meses antes do isolamento de células estreladas. Cerca de 2x10 5 células estreladas hepáticas pode ser purificado a partir do fígado de um camundongo C57BL / 6, enquanto o rendimento de células estreladas de camundongos Balb / c é consideravelmente maior. O protocolo que se segue é ajustada para 5 camundongos. Cuidados com os animais e experimentação foram realizados em conformidade com o Animal Care aprovado Institucional e protocolos Comitê Use. 1. Na perfusão in situ de fígado de camundongos com enzimas digestivas <ol><li> Aquecer o tampão SC1 e soluções para perfusão enzima em banho-maria a 37 ° C. </li><li> Montar um set de infusão com asas no tubo de silicone de uma bomba peristáltica. </li><li> Calibrar a bomba com PBS para obter um fluxo laminar de 6.5ml/min, que é a vazão que serão utilizados para a situ na perfusão do fígado. Equilibrar o tubo de silicone com SC1 solução. </li><li> Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e solução de teste de perda de reflexos para garantir narcotização profundo. </li><li> Corrigir o mouse na posição supina em uma superfície apropriada. </li><li> Use uma tesoura e uma pinça para realizar uma incisão longitudinal na pele abdominal e expor o peritônio. </li><li> Abra cuidadosamente o peritônio e mover os intestinos para fora da cavidade abdominal para o lado esquerdo do animal a fim de expor a veia portal. </li><li> Inserir a cânula do conjunto de perfusão na veia portal. Para esta etapa, o uso de um microscópio estereoscópico é recomendado. </li><li> Iniciar a perfusão do fígado com solução SC1 30ml. Abra a veia cava inferior imediatamente após o início do fluxo. Rubor bem sucedida do fígado é indicada por uma perda de cor do tecido do fígado. </li><li> Perfundir o fígado com a solução de 30ml pronase E. Após a digestão bem-sucedido, os lobos do fígado vai inchar, e os lóbulos aparecerá distintas através da cápsula. </li><li> Perfundir o fígado com a solução de colagenase P 30ml. O fígado neste momento perdeu sua forma e aparência atônica e amorfo. </li><li> Separe cuidadosamente o fígado a partir do diafragma e órgãos circundantes e armazená-lo em 70ml de solução SC2 no gelo. </li><li> Repita o procedimento para ratos adicionais. </li></ol> 2. Digestão in vitro de fígado de camundongos Todas as outras etapas de trabalho deve ser realizado sob condições estéreis em capela de fluxo laminar. <ol><li> Corte o fígado em pedaços de aproximadamente 2x2x2mm 3 usando uma tesoura afiada. </li><li> Combine a suspensão de 70ml SC2 incluindo os pedaços de fígado com 50ml de solução pronase P E-colagenase e adicionar 1 ml de solução de DNase I. </li><li> Digerir os fígados por 20min a 37 ° C, agitando. </li></ol> 3. Centrifugação em gradiente de densidade <ol><li> Filtrar a suspensão de células através de filtros de células 70μm em 6 tubos de 50ml Falcon e adicionar até 50ml com SC2 buffer. Centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente 40ml do sobrenadante, em seguida, adicione 150μl DNase solução que eu a cada tubo e ressuspender as células. </li><li> Piscina das suspensões de células em 4 tubos de 50ml Falcon e lave com GBSS-B, centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente o máximo de sobrenadante quanto possível, sem perturbar o sedimento e adicionar 150μl DNase solução que eu a cada tubo. Ressuspender o pellets de células em 10ml GBSS-B por tubo. </li><li> Piscina as células em dois tubos de 50ml Falcon e adicione GBSS-B para um volume total de 36ml por tubo. Adicionar 14ml de solução Nycodenz a cada tubo e misture bem. </li><li> Transferência de 10ml da suspensão de células em um tubo de centrifugação 12ml gradiente, resultando em 10 tubos no total. Delicadamente sobrepor a suspensão de células com 1,5 ml GBSS-B por tubo. </li><li> Centrifugar os gradientes de 15 min a 1500g e 4 ° C, sem freio. Posteriormente, hepatócitos será peletizada na parte inferior do tubo enquanto que as células estreladas são encontrados na interfase como um anel branco. </li><li> Cuidadosamente a colheita interfase contendo as células estreladas e lavá-los com GBSS-B; centrifugar por 10 minutos em 600g e 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em DMEM suplementado com 20ml inativado pelo calor de 10% FBS, HEPES 1% Penicilina / Estreptomicina, 2mM L-Glutamina, piruvato de sódio 1 mM e 10 mM. Transferência das células em frascos de cultura de tecidos com uma concentração de 2x10 4 células / cm 2. Incubar as células a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Troque a mídia assim que as células estreladas hepáticas são aderentes (cerca de 2h após a preparação) para lavar as células mortas e restos celulares. </li><li> No dia seguinte, a célula estreladass deve desenvolver sua morfologia em forma de estrela com característica perinuclear vesículas vitamina A-armazenar lipídios. </li><li> Para os experimentos subseqüentes, as células estreladas hepáticas pode ser facilmente destacado das superfícies não-revestido de plástico leve usando soluções enzimáticas, tais como Accutase, por exemplo, </li></ol> 4. Resultados representativos: Após a preparação de células estreladas hepáticas utilizando o protocolo fornecido, a pureza da população isolada podem ser testadas considerando três principais características deste tipo de célula, como estrelas, como a forma, gotículas lipídicas perinuclear, e expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP ). Imagens representativas para o aspecto característico de células estreladas hepáticas 2h após o isolamento de células, bem como no dia 1 e 3 de cultura in vitro são apresentadas na Figura 1. A Figura 2 mostra uma coloração representante de imunofluorescência para GFAP em células estreladas hepáticas, que foram cultivadas por 3 dias após o isolamento de células. Células estreladas hepáticas diferenciar em células miofibroblástica durante a cultura in vitro. A marca característica dessas células estreladas ativadas é a expressão de alfa actina de músculo liso (αSMA). A Figura 3 mostra a coloração de imunofluorescência para ASMA e IIA miosina em células estreladas ativadas no dia 7 de cultura in vitro. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Morfologia característica de células estreladas hepáticas. Células estreladas foram isoladas de fígado de camundongos usando o protocolo fornecido. As imagens retratam 2h células estreladas após o isolamento da célula (a, b), bem como no dia 1 (c) e dia 3 (d) de cultivo in vitro. Células estreladas hepáticas apresentam grandes quantidades de vesículas lipídicas em locais perinuclear e adquirir sua morfologia astral distintivo como durante os primeiros dias de cultivo in vitro (Ampliação de 200x). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Células estreladas hepáticas especificamente expressar GFAP no fígado. Células estreladas foram isoladas e coradas para immunofluorescently GFAP (vermelho) no dia 3 de cultura in vitro. Núcleos das células são representadas em azul (Hoechst mancha). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Células estreladas hepáticas diferenciar em miofibroblastos. Células estreladas hepáticas isoladas de camundongos C57BL / 6 foram cultivadas por 7 dias. Posteriormente, eles foram transferidos para câmara de slides e corados para ASMA (mostrada em vermelho) e IIA miosina (representado em verde). Os núcleos das células foram contracorados com Hoechst (azul). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> SC1 buffer </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 190mg </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 900mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 ml de solução 1M de ações </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> Vermelho de fenol </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> preencher até 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> SC2 buffer </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 560mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10ml de solução estoque 1M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> Vermelho de fenol </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> preencher até 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> GBSS-A Tampão </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> Vermelho de fenol </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> preencher até 1l </td></tr><tr><td colspan="2">GBSS-B buffer </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> Vermelho de fenol </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> preencher até 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase solução de perfusão E </td></tr><tr><td> E pronase </td><td> 100mg (4000 PU / mg min) </td></tr><tr><td> SC2 buffer </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Colagenase solução de perfusão P </td></tr><tr><td> Colagenase P </td><td> 85mg (1,78 U / mg lyo) </td></tr><tr><td> SC2 buffer </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E-colagenase Solução P </td></tr><tr><td> E pronase </td><td> 50mg (4000 PU / mg min) </td></tr><tr><td> Colagenase P </td><td> 85mg (1,78 U / mg lyo) </td></tr><tr><td> SC2 buffer </td><td> 50ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Solução DNase I </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 6mg (ca. 2000U/mg) </td></tr><tr><td> GBSS-B </td><td> 3ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nycodenz Solution </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> 8g </td></tr><tr><td> GBSS-A </td><td> 28ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Buffers e soluções de enzima necessária para o isolamento de células estreladas hepáticas. O pH de todos os buffers deve ser ajustado para 7,3-7,4. Além disso, a filtração estéril de todos os buffers é recomendado. É importante adaptar a quantidade de enzima utilizada de acordo com a determinada atividade enzimática.

<ol><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Geerts, A. H. istory <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li>
<li>Gressner, A. M. &amp, Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li>
<li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li>
<li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li>
<li>Minicis, S. D. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li>
<li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers%3A+distinct+roles+of+%28myo-%29fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Células estreladas hepáticas regular essenciais processos fisiológicos e fisiopatológicos no fígado. Além disso, as células estreladas possuem propriedades apresentadoras de antígenos, tornando-os um importante componente da resposta imune hepática. Embora as células estreladas hepáticas compreendem 10-15% do número total de células no fígado, o isolamento dessas células é um desafio devido à sua localização no espaço de Disse perisinusoidal. Aqui apresentamos um método simples para isolar a...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Catalog No. </th></tr><tr><td> 70μm Filtro celular </td><td> BD </td><td> 352350 </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> Colagenase P </td><td> Roche </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11960 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 cv- </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> Tubos de centrifugação de gradiente </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 163160 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 63068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71643 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-7523-70 </td></tr><tr><td> Vermelho de fenol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> E pronase </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> Tubo de silicone </td><td> Masterflex </td><td> HV-96440-14 </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> Frasco de cultura de tecidos (25 cm 2) </td><td> BD </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Set de infusão com asas </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

sete passos para stellate células

Seven Steps to Stellate Cells

Células estreladas hepáticas são fígado residente células de estrelas, como morfologia e estão localizados no espaço de Disse entre fígado sinusoidal células endoteliais e hepatócitos 1,2. Células estreladas são derivados de precursores da medula óssea e armazenar até 80% do total do corpo de vitamina A 1, 2. Após a ativação, as células estreladas diferenciar em miofibroblastos para produzir matriz extracelular, contribuindo para a fibrose hepática 3. Base na sua capacidade de contratar, as células estreladas miofibroblástica pode regular o tom vascular associada à hipertensão portal 4. Recentemente, nós demonstramos que as células estreladas hepáticas são células antígeno apresentando potentes e podem ativar as células NKT, bem como convencionais linfócitos T 5. Aqui apresentamos um método eficiente para a preparação de células estreladas hepáticas do fígado do rato. Devido à sua localização perisinusoidal, o isolamento de células estreladas hepáticas é um processo multi-passo. A fim de tornar as células estreladas acessíveis ao isolamento do espaço de Disse, fígado de camundongos são perfundidos in situ com a enzimas digestivas pronase E e perfusão colagenase P. Em seguida, o tecido hepático é submetido a tratamento enzimático adicionais com pronase E e P colagenase em vitro. Posteriormente, o método tira proveito da enorme quantidade de gotículas de vitamina A de armazenamento de gordura nas células estreladas hepáticas. Este recurso permite a separação de células estreladas de outros tipos de células hepáticas por centrifugação em um gradiente Nycodenz 8%. O protocolo aqui descrito produz uma população altamente pura e homogénea de células estreladas. Pureza das preparações podem ser avaliados através da coloração para a molécula de proteína glial fibrilar ácida marcador (GFAP), antes da análise por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. Além disso, microscopia de luz revela a aparência única em forma de estrela de células hepáticas estreladas que abrigam grandes quantidades de gotículas lipídicas. Tomados em conjunto, nós apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento eficiente de células estreladas hepáticas, incluindo imagens representativas de sua aparência morfológica e expressão GFAP que ajudam a definir a entidade de células estreladas.

Aqui nós descrevemos um método para o isolamento de células estreladas hepáticas do fígado do rato. Para a purificação de células estreladas, fígado de camundongos são digeridos<em&gt; In situ</em&gt; E<em&gt; In vitro</em&gt; Por pronase colagenase-tratamento antes da centrifugação em gradiente de densidade. Esta técnica produz células estreladas hepáticas de alta pureza.

Sete Passos para Stellate Células

As células estreladas hepáticas são células residentes do fígado com morfologia estrelada e localizam-se no espaço de Disse, entre as células endoteliais sinusoidais hepáticas...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células estreladas hepáticas do fígado de camundongo. Isso é realizado primeiramente por meio da perfusão in situ do fígado de camundongos com enzimas digestivas. Após a perfusão, os fígados são cortados em pequenos pedaços para aumentar a eficiência da digestão in vitro, que é realizada em seguida.Como etapa final, as células estreladas hepáticas são separadas de outros tipos celulares hepáticos por centrifugação em gradiente de densidade. Em última instância, as células estreladas hepáticas são obtidas e sua pureza pode ser avaliada por microscopia de luz e imunofluorescência. O procedimento será demonstrado por Patrick Meyer, um estudante de pós-graduação de um laboratório. Em preparação para a perfusão NC dois de fígados de camundongo, aqueça primeiro as soluções de buffer SC um e de enzima em banho-maria a 37 graus Celsius.Em seguida, configure a bomba peristáltica para obter um fluxo laminar de 6,5 mililitros por minuto e equilibre o tubo de silicone da bomba com a solução SC um. Agora, confirme, pela perda de reflexos, que o camundongo anestesiado está profundamente sedado. Em seguida, fixe o camundongo em posição supina sobre uma base apropriada.Use tesoura e pinça para realizar uma incisão longitudinal na pele abdominal e expor o peritônio. Abra cuidadosamente o peritônio e desloque os intestinos para fora da cavidade abdominal, posicionando-os no lado esquerdo do animal, a fim de expor a veia porta. O aspecto mais difícil deste procedimento é a perfusão zeto dos fígados com enzimas digestivas, a qual será demonstrada.Em seguida, é importante utilizar um microscópio estereoscópico ao inserir a cânula e monitorar atentamente as alterações nas estruturas hepáticas durante a perfusão. Trabalhando sob um microscópio estereoscópico, insira a cânula do conjunto de infusão na veia porta. Inicie a perfusão do fígado com 30 mililitros da solução SC um. Abra imediatamente a veia cava inferior logo após iniciar o fluxo.O sucesso da lavagem do fígado é indicado pela perda de cor do tecido hepático. Em seguida, examine o fígado com 30 mililitros de solução de Pronase E. Os lobos hepáticos incharão e os lóbulos aparecerão distintos através da cápsula após a perfusão com solução de colagenase P perfundida com 30 mililitros de solução de colagenase P. Quando a perfusão com colagenase P estiver completa, colete o fígado do camundongo dissecando-o cuidadosamente do diafragma e dos órgãos adjacentes e armazene-o em 70 mililitros de solução SC dois em gelo.O fígado nesse momento perdeu sua forma e apresenta-se atônico e amorfo. O procedimento para a digestão de fígados de camundongo deve ser realizado em condições estéreis. Em uma cabine de fluxo laminar.Use uma tesoura afiada para cortar os fígados em pedaços de aproximadamente dois por dois por dois milímetros cúbicos. Em seguida, combine a suspensão de 70 mililitros de SC dois e os pedaços de fígado com 50 mililitros de solução de protease E colagenase P. Adicione um mililitro de dna, uma solução, e digira os fígados por 20 minutos a 37 graus Celsius sob agitação.Após a digestão enzimática do tecido hepático, as células estreladas são separadas de outros tipos celulares hepáticos por centrifugação em gradiente de densidade. Para iniciar este procedimento, filtre a suspensão celular através de peneiras celulares de 70 micrômetros em seis tubos cónicos de 50 mililitros e lave as células com tampão E2, centrifugando por 10 minutos a 600 ×g e 4 graus Celsius. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente 40 mililitros do sobrenadante de cada tubo.Em seguida, adicione 150 microlitros da solução de DNA a cada tubo e ressuspenda as células. Reúna as suspensões celulares em quatro tubos Falcon de 50 mililitros e lave com G-B-S-S-P centrifugando por 10 minutos a 600 Gs e 4 graus Celsius. Aspire cuidadosamente o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione 150 microlitros da solução de DNA a cada tubo.Suspendemos os pellets celulares em 10 mililitros de G-B-S-S-B por tubo. Reúna as células em dois tubos cónicos de 50 mililitros e adicione G-B-S-S-B até um volume total de 36 mililitros por tubo. Adicione 14 mililitros de solução den por tubo e misture bem.Em seguida, transfira 10 mililitros da suspensão celular para um tubo de centrifugação em gradiente de 12 mililitros, resultando em um total de 10 tubos. Sobreponha suavemente a suspensão celular com 1,5 mililitro de G-B-S-S-B por tubo. Centrifugue os gradientes por 15 minutos a 1500 Gs e quatro graus Celsius sem freio.Posteriormente, os hepatócitos serão sedimentados no fundo do tubo, enquanto as células estreladas serão encontradas na interface como um anel branco. Usando uma pipeta de cinco mililitros, colete cuidadosamente a interface contendo as células estreladas e transfira para um tubo de 50 mililitros. Lave as células adicionando G-B-S-S-B e centrifugando por 10 minutos a 600 Gs e quatro graus Celsius.Aspire o sobrenatante e ressuspenda as células em 20 mililitros de DMEM com suplementos. Após a contagem das células, transfira-as para frascos de cultura celular numa concentração de dois vezes 10 à quarta células por centímetro quadrado e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Aproximadamente duas horas após a sua preparação, as células estreladas hepáticas devem estar aderidas; troque o meio para remover células mortas e debris celulares.Retorne as células ao incubador. Os resultados representativos do preparo de células estreladas hepáticas a partir de fígados de camundongos usando este protocolo são mostrados aqui. Células no primeiro e no terceiro dia de cultura in vitro exibem a morfologia característica das células estreladas hepáticas. Elas têm formato astrocítico e apresentam acúmulo de vesículas lipídicas.Em locais perinucleares, a pureza das células estreladas hepáticas isoladas também pode ser verificada pela expressão da proteína ácida fibrilar glial ou GFAP. Essas imagens mostram uma coloração imunofluorescente representativa para GFAP, mostrada em vermelho nas células estreladas hepáticas, que foram cultivadas por três dias após o isolamento celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células estreladas hepáticas de fígado normal para obter um rendimento adequado de células estreladas puras.É importante garantir uma digestão eficiente durante a perfusão hepática. Por fim, é essencial determinar a integridade adequada das células isoladas mediante a avaliação da morfologia e do fenótipo das células hepáticas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Derivação de precursores de neuroepiteliais-tronco embrionárias (ES) utilizando células do estroma atividade induzir células derivadas (SDIA).

Cell-ES derivadas Neuroepiteliais culturas de células

Este vídeo demonstra um protocolo para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em progenitores cerebelares. Envolve a transferência de colônias de células-tronco para uma placa de fixação ultrabaixa para formar corpos embrióides, promovendo a diferenciação com fatores de crescimento e, em seguida, transferindo os corpos embrióides para uma placa revestida com matriz para adesão. As etapas subsequentes envolvem a indução da migração celular e a adição de um meio de...

Uma técnica para gerar uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

O ciliado gigante Stentor coeruleus é um sistema clássico para estudar a regeneração e a cicatrização de feridas em células únicas. Ao obter imagens das células do Stentor simultaneamente em baixa e alta ampliação, é possível medir os fluxos citoplasmáticos antes, durante e após a ferida.

Visualizando o fluxo citoplasmático durante a cicatrização de feridas unicelulares em Stentor coeruleus

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.

Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Alterações fisiopatológicas no sistema nervoso autônomo cardíaco, especialmente em seu ramo simpático, contribuem para o surgimento e manutenção de arritmias ventriculares. No presente protocolo, mostramos como caracterizar gânglios estelares murinos para melhorar a compreensão dos processos moleculares e celulares subjacentes.

Localização, Dissecção e Análise do Gânglio Murine Stellate

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, purificação e cultivo de células marginais primárias da stria vascular do camundongo, e para estabelecer modelos in vitro de estresse oxidativo e senescência celular para estudar distúrbios da parede lateral coclear.

Isolamento e Cultura de Células Marginais Primárias da Stria Vascularis de Camundongos Neonatais

Aprenda a isolar células estreladas hepáticas de fígado de camundongo usando perfusão enzimática e centrifugação em gradiente de densidade. Este método garante alta pureza celular para pesquisas em biologia hepática.

Sete Passos para Stellate Células

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