Transmembrana Propensão Oligomerização Domínio determinado pelo Assay ToxR

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar as propensões de ligamentização de proteínas, domínios transmembrana ou T MDs em um ambiente de membrana natural. Isso é obtido expressando o domínio transmembrana de interesse em e coli como uma proteína quimérica com proteína de ligação à maltose para localização no periplasma e tox. R como repórter transcricional, a ligamentização induzida pelo domínio transmembrana resulta na dimerização do tox R e ativação da transcrição LXi Como uma segunda etapa, as células são lisadas e tratadas com ONPG, que é hidrolisado por beta galacto para a espécie absorvente de luz O nitro folato ou ONP.

Os próximos níveis de ONP são quantificados medindo a absorbância da luz em 405 nanômetros. Para determinar os níveis do domínio transmembrana, os resultados da ligamentização revelam a propensão à ligamentização dos domínios transmembrana com base em um ensaio repórter tox R. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos biofísicos existentes, como página SDS ou fluorescência, é que o comportamento do domínio transmembrana é estudado em uma bicamada fosfolipídica natural pela expressão em e coli, em vez de um sistema mimético de membrana, como um detergente.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da proteína de membrana, como a elucidação das principais características estruturais envolvidas na associação de hélice transmembrana Antes do início deste protocolo, sete plasmídeos de varíola expressando a proteína quimérica necessária são preparados a partir de oligonucleotídeos sintetizados comercialmente, representando o TDS de interesse flanqueado por NHE um e BMH um. Os locais de restrição após a preparação dos plasmídeos descongelam suavemente as células competentes em gelo. Depois de descongelados, as células foram transferidas para tubos de cultura de 15 mililitros a 200 nanogramas de cada DNA plasmático para um tubo separado e incubaram as células no gelo por 30 minutos.

Em seguida, choque térmico das células por 90 segundos a 42 graus Celsius, seguido de incubação em gelo por dois minutos a 800 microlitros de meio SOC e incubar as amostras a 37 graus Celsius com agitação por uma hora após a incubação, inocular cinco mililitros de meio LB contendo cloranfenicol e aose com 50 microlitros da mistura de transformação usando tubos de cultura de 15 mililitros em triplicata para cada amostra. Por fim, incubar as amostras a 37 graus Celsius com agitação por 20 horas. Para medir toda a ligamentização da TDS, a atividade da beta galacta tase é determinada.

Primeiro, pré-aqueça o leitor de placas a 28 graus Celsius. Utilizar o depósito regulador Z para preparar novas soluções tampão Z, tal como descrito no protocolo escrito. Transfira o clorofórmio tampão Z do tubo para o reservatório, certificando-se de canalizar apenas a camada aquosa superior do clorofórmio tampão Z.

Coloque a placa de 96 poços em um pedaço de papel com uma grade desenhada para garantir a pipetagem precisa, transfira 100 microlitros de clorofórmio tampão Z para cada poço de uma placa de 96 poços, seguido por cinco microlitros de cada cultura em quad. Duplicar omitir a cultura dos quatro poços que servirão como espaços em branco. Meça o OD 5 95 da placa para determinar a densidade celular.

Adicione 50 microlitros de tampão Z SDS a todos os poços da placa. Em seguida, agite a placa no leitor de placas por 10 minutos para colocar as células após a lise celular a 50 microlitros de ZPA para ONPG em todos os poços. Retorne a placa ao leitor de placas e meça OD 4 0 5 a cada 30 segundos por 20 minutos.

Determine o nível de atividade da beta lacto sase por meio de um cálculo de unidades de Miller normalizando para o branco. O Western blotting é realizado para verificar a expressão proteica equivalente entre as construções. Primeiro, combine 50 microlitros das culturas triplicadas e, em seguida, centrifugue as amostras usando uma microcentrífuga.

Remova o sobrenadante pipetando e resus. Suspenda o pellet residual em dois x tampão de carga de amostra 7,5 microlitros de cada amostra em um gel padrão de 8% e realize a eletroforese a 125 volts por uma hora e cinco minutos após a transferência. Incubar a membrana com anticorpo conjugado anti M-V-P-H-R-P para visualizar a proteína quimérica é observada em aproximadamente 70 kilodaltons com alguns produtos de degradação às vezes vistos em torno de 48 kilodaltons.

O MVP endógeno também é observado em 45 kilodaltons. A fim de avaliar a inserção adequada da membrana da construção quimérica de TMD, a linha celular PD 28 deficiente em proteína de ligação à maltose é usada quando cultivada em meio mínimo com maltose como única fonte de carbono, apenas células que expressam um produto de expressão integral de membrana com proteína de ligação à maltose corretamente localizada no periplasma podem crescer. Transforme as células PD 28 conforme descrito para as células fhk 12 e inocule dois mililitros de meio LB.

Cultive as células a 37 graus Celsius com agitação a 300 RPM durante a noite após a incubação. Pellet as células por centrifugação e lavagem por suspensão Resus em dois mililitros de PBS e pipetagem suave com uma ponta grande. Após a peletização, as células lavam novamente com PBS pela segunda vez, depois realizam uma centrifugação final e ressusam a suspensão em um mililitro de PBS.

Use 25 microlitros das células ressuspensas para inocular cinco mililitros de meio mínimo. Incubar as células de 37 graus Celsius com agitação em 15 horas. Transfira 200 microlitros de cada amostra para uma placa de 96 poços e faça a leitura OD 5 9 5 usando o leitor de placas.

Repita este processo a cada duas horas até 25 horas. A propensão a toda a ligamentização de domínios transmembranares individuais da proteína integral de membrana multis abrangendo a proteína de membrana latente uma foi analisada usando o ensaio repórter transcricional tox R. O domínio transmembrana cinco exibe uma forte propensão ao aumento da liga, conforme demonstrado por altas unidades de Miller, que é comparável à sequência de dimerização bem estabelecida do GPAA de controle positivo.

Uma mutação deletéria no domínio transmembrana cinco D one 50 A reduz a capacidade da sequência de todos os ligas de aumento LMP um, TM um não aumenta significativamente todas as ligas e exibe um sinal de unidade de Miller muito baixo logo acima do sinal para branco, que é FHK 12 células não transformadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar se uma hélice transmembrana de interesse tem a capacidade de formar complexos de ordem superior em um ambiente de membrana natural Ao tentar este procedimento, é importante pipetar com muito cuidado na placa de 96 poços para evitar grandes erros e garantir que nenhuma bolha de ar seja introduzida.