Name: Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprenda métodos para avaliar a morte de células beta pancreáticas mediada por linfócitos T citotóxicos CD8+ usando ensaios de liberação de Cr-51 e imagem de células vivas. Essas técnicas permitem estudar a patogênese do diabetes tipo 1.

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Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e DK074656 AI56374 (CEM), bem como o Juvenile Diabetes Research Foundation.

1. Preparação de células <ol><li> Cultura de células alvo: Cultura do mouse linhas de células beta, NIT-1 e NIT-4, foi um 1,2 descrito anteriormente em DMEM suplementado com 10% de SFB, BSA 0,02%, não-essenciais Aminoácidos, 15mM HEPES, 16.5mm Glocose e penicilina / estreptomicina. Por 51 Cr rotulagem, as células de semente em um flat-bottom de 96 poços na placa de cultura 5X10 4 células / poço em 200 mL meio de cultura. Para experimentos de microscopia, as células de semente em um oito bem-Lab-Tak II chambered lamela em 5x10 4 por câmara em 500 mL meio de cultura, e deixe crescer por 48 horas antes de usar nos experimentos de citotoxicidade. </li><li> Controle T cultura linha celular: Use a linha de células Jurkat (ATCC, CD3 + linha de células de linfócitos humanos) como controle negativo. Cultura de células Jurkat em RPMI1640 suplementado com 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, bicarbonato de sódio 1,5 g / L, 10 mM HEPES e 1,0 mM piruvato de sódio. </li></ol> 2. Coleta e ativação de efetores autoreactive células T CD8 + NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] e NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] foram adquiridos do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) e criados em nossa unidade de mouse. Progênie híbrida F1 a partir de acasalamentos de NOD-AI4a com NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] desenvolver diabetes em 3-5 semanas de idade. Todos os animais foram alojados em patógenos específicos livre de instalações e aprovadas pelo Atendimento a instituição do Comitê Animal e Uso. <ol><li> Euthanize 3-4 semanas de idade NOD-AI4a / b camundongos usando CO 2. </li><li> Coletar baços de camundongos. Camundongos sacrificados são preparados com spray de etanol e abriu sob o capô cirúrgico. Baços são removidos e colocados em gelo frio tampão HBSS imediatamente. </li><li> Coletar células do baço usando um homogeneizador de vidro 7 mL. Dois a três baços cada são colocados em 5 mL de HBSS frio e homogeneizado com um 7 mL de vidro homogeneizador. Homogeneizado é coletado e centrifugado a 1200rpm por 5 minutos a 4 ° C usando um Sorvall RT7 centrífuga +. Pellets celulares são recolhidos. </li><li> Remover as células vermelhas do sangue usando o tratamento solução hipotônica. Pelotas são tratados com 5 mL de solução hipotônica / baço em gelo durante 5 minutos, em seguida neutralizada pela adição de igual volume de HBSS. Coletar células por centrifugação, como acima, e ressuspender em 50 HBSS mL. Passe as células em suspensão através de peneira de células e contagem utilizando um hemocitômetro com coloração TrypanBlue. </li><li> Ativam as células. Ressuspender as células em 5x10 6 mL / e ativar usando uma cultura 3 dias com 0,1 mM AI4 mimotope (YFIENYLEL sequência de aminoácidos) e 25 U / mL IL-2 em RPMI1640 suplementado com 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sódio, 10 mM HEPES e 1,0 mM piruvato de sódio. </li></ol> 3. 51 ensaio de liberação de Cr para examinar CML <ol><li> Células-alvo etiqueta: Add 51 Cr para atingir as células em 1 μCi / poço e cultura para 3 horas, e lavar 3 vezes com meio de cultura. </li><li> Suspender células efetoras em meio RPMI 1640, como mencionado no passo 2,5 para que o volume final adicionados a cada poço é de 200 mL. </li><li> Após a lavagem final das células-alvo rotulado, adicione ativação de células efetoras para as culturas de células-alvo em efetoras desejado para o destino (E: T) rácios. Nós usamos geralmente E: relações T em 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 e 50:1. </li><li> Adicionar novas modificada RPMI 1640 (veja o passo 2.5) a 6 poços de células-alvo para atuar como um controle de lise espontânea. </li><li> Co-cultura de células efetoras e meta para 16 horas. </li><li> Recolher o sobrenadante em tubos de vidro 6x50 milímetros Lime </li><li> Lisar células adicionando 100μl SDS 2% e pipetagem várias vezes suavemente. </li><li> Coletar lisado celular em outro conjunto de 6x50 milímetros tubos de vidro Lime. </li><li> Lavar uma vez com poços limpa H 2 O e adicione a lavagem para os tubos lisado celular. </li><li> Contar os sobrenadantes e lisados ​​celulares usando um contador gama. </li><li> Calcular a lise específica da seguinte forma: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="Equação 1"></li></ol> 4. Coloração de células para imagens de células vivas Entre os mais comumente utilizados corantes potencial de membrana mitocondrial, TMRM exibe a toxicidade mitocondrial, pelo menos. 3 Por isso, escolhemos TMRM para estes estudos de imagem de células vivas. <ol><li> Prepare uma solução de 40 mM TMRM estoque em DMSO e armazenar a -20 ° C. Faça uma [25 nM] solução de trabalho fresca em vermelho de fenol livre de DMEM com todos os suplementos para NIT-1 cultura de células 1. </li><li> Mancha-alvo NIT-1 com células TMRM 25 nM por 30 min a 37 ° C. </li><li> Substituir a mídia com a mídia fresco contendo 5 nM TMRM para manter a distribuição de equilíbrio dos 4 corante. </li><li> Contar efetoras ativadas AI4 células T usando um hematocytometer. </li><li> Mancha efetoras ativadas AI4 células T com 1 ml / mL para Picogreen5 minutos à temperatura ambiente e lave com vermelho de fenol livre de meio de cultura 3 vezes. </li></ol> 5. Avaliação de linfócitos T mediada por morte de células beta usando imagens de células vivas <ol><li> Montar a lamínula chambered com células NIT manchada no palco de uma Zeiss LSM 510 microscópio confocal. Remova a guia com um dremmel e gás esterilizar o vidro com óxido de câmaras Etheline. O palco é equipado com uma câmara de imagens ao vivo de células que tem temperatura controlada a 37 ° C e 5% CO 2 com a umidade. </li><li> Adicionar ativado e corados células T para câmaras designados ao E diferente: relações T. </li><li> Adicionado mesmo número de células Jurkat manchada para as câmaras de controle. </li></ol> 6. Obtenção de imagens de células vivas O microscópio é equipado com um palco motorizado que nos permitiu adquirir imagens repetidas vezes em diferentes locais das câmaras iguais ou diferentes automaticamente ao longo do tempo do experimento. <ol><li> Usando uma lente 63x de petróleo objetivo, tirar fotos em um intervalo de três minutos cada para um total de 300 quadros por localização. </li><li> Detectar coloração TMRM usando um comprimento de onda de excitação de 543 nm e conjunto de filtros para emissão de 565-619 nm </li><li> Detectar Picogreen coloração com uma excitação 488 nm e um conjunto de filtros para emissão de 500-630 nm. O vídeo foi criado usando software Zeiss LSM. </li></ol> 7. Conversão de vídeo para publicação <ol><li> Usando o software LSM Zeiss, criar um arquivo de filme não compactado em um formato AVI. </li><li> Para converter o vídeo para o formato publicado, importe o vídeo para o pacote de software FIJI ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), um ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) de distribuição, usando o plugin Bioformats de locos ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Ajustar as configurações de brilho e contraste para equilibrar os sinais verde e vermelho ea taxa de quadros foi definido como 2 frames / segundo usando a animação do menu de opções. </li><li> Recortar o vídeo para 512 x 512 pixels e exportar como um arquivo AVI sem compressão. </li><li> Abrir este arquivo AVI no QuickTime 7 software (computador Apple, Cupertino, CA) e comprimir e de exportação no formato aberto de arquivo de vídeo H264/MPEG-4 a 1200 kbs / segundo. </li></ol> 8. Resultados representativos: <ol><li> Um resultado representativo de 51 ensaio CML Cr. A Figura 1 mostra um resultado representativo de um ensaio onde CML lise por cento específicos (eixo Y) aumenta à medida que o Effector: relação Target (eixo X) aumenta. Células-alvo são ilhotas primária isolada a partir de NOD imunodeficientes RAG1-/ -. Ratos e rotulado com 51 Cr. Esplenócitos dos NOD.AI4α / β camundongos transgênicos são isoladas e ativados como descrito na etapa 2 acima. Metas e efetores foram co-cultivados por 16 horas. Lise por cento específico é calculado conforme descrito no passo 3.11. </li><li> Dois representante (positivo e negativo) resulta de um T-mediada por células beta dissipação de célula de membrana mitocondrial em potencial são apresentados. Células são coradas e reações são registradas como descrito nas etapas 4, 5 e 6 acima, arquivos de vídeo são criados como no passo 7. Vídeo 1: O mouse linhagem de células beta NIT-1 foi manchado o potencial de membrana mitocondrial TMRM corante (vermelho). Ativado, autoreactive CD8 + células T AI4 (verde manchado com Picogreen) foram co-cultivados com essas NIT-1 células em uma razão E: T de 50:1. NIT-1 potencial de membrana mitocondrial dissipada gradualmente durante uma duração de 400 minutos, mas apenas nos clusters que foram interagindo com células T AI4. Vídeo 2: Como um experimento de controle, NIT-1 as células foram coradas com TMRM e co-cultivados com células Jurkat Picogreen manchada em uma razão E: T de 50:1. Células Jurkat são uma linha de células T humanas que é MHC incompatíveis. NIT-1 células mantidas potencial de membrana mitocondrial durante toda a duração de 400 minutos a co-incubação período. Células Jurkat não interagir com NIT-1 clusters e, portanto, não provocar o assassinato. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1 resultado Representante da CML usando como células-alvo primárias ilhotas isoladas de imunodeficientes NOD.Rag1-/ -. Ratos e esplenócitos de NOD.AI4α / β camundongos transgênicos. Metas e efetores foram co-cultivados por 16 horas. Lise por cento específica aumenta com o Effector: aumenta a proporção Target. Vídeo 1. Rato linha de células beta NIT-1 foi manchado a membrana mitocondrial potencial corante TMRM (Red). Ativado autoreactive CD8 + células T AI4 (verde manchado com Picogreen) foram co-cultivados com essas NIT-1 em células razão E: T de 50:1. NIT-1 potencial de membrana mitocondrial dissipaçãoted gradualmente durante uma duração de 400 minutos, mas apenas nos clusters que estavam interagindo com o verde AI4 células T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Clique aqui para assistir ao vídeo</a> . Video 2. NIT-1 as células foram coradas mesma, conforme descrito no vídeo 1 e co-cultivados com Picogreen T humanas manchada Jurkat linha celular. NIT-1 as células foram capazes de manter o potencial de membrana mitocondrial pensado a duração de 400 minutos. Células Jurkat não interagir com NIT-1 clusters e, portanto, não provocar o assassinato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Clique aqui para assistir ao vídeo</a> .

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade da Flórida Animal Care Institucional e Comitê de uso.

Citotóxica de células T morte celular mediada beta está a fisiopatologia das principais DM1 5. CML ensaios utilizando 51 Cr lançamento nos permitem estudar o grau de meta-efetoras de resposta 6. No entanto, o processo detalhado e os caminhos da morte das células T mediada por células beta ainda não é totalmente compreendido. Uma vez que as mitocôndrias são críticos para a função das células beta ea morte 7, centrada em mudanças mitocondrial durante a CML visual. Dissipação de ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrametil Rodamina Methyl Ester (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> seqüência de aminoácidos: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM Non-Aminoácidos Essenciais </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gêmeos </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Vermelho de fenol livre de DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HeraCell 150i </td><td> Mantido estéril para cultura de células </td></tr><tr><td> Cabines de segurança biológica </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Descartáveis ​​tubos de cultura, 6x50 milímetros de vidro Lime </td><td> Pescador </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> Contador gama </td><td> Perkin Elmer </td><td> Assistente de contador gama automático 1470 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta Confocal </td><td> Com estágio motorizado e câmara de células vivas </td></tr><tr><td> Pipeta (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubos (Amber) </td><td> Pescador </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio na posição vertical </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Ratos </td><td> O Laboratório de Jackson </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Ratos </td><td> O Laboratório de Jackson </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β camundongos F1 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> UF criados em instalações para animais </td></tr></tbody></table>

métodos para avaliar mediated beta morte celular por linfócitos t citotóxicos

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença mediada por células T auto-imunes. Durante a patogênese, os pacientes tornam-se progressivamente mais insulinopenic como a produção de insulina está perdido, presumivelmente, o que resulta da destruição das células beta pancreáticas pelas células T. Compreensão dos mecanismos de morte das células beta durante o desenvolvimento do DM1 irá fornecer informações para gerar uma cura eficaz para esta doença. Mediada por células linfocitotoxicidade (CML) ensaios têm historicamente utilizado o Chromium radionuclídeos 51 (51 Cr) para rotular as células-alvo. Estas metas são, em seguida, expostos a células efetoras e da liberação de 51 Cr a partir de células-alvo é lido como uma indicação de linfócitos mediada por morte celular. Inibidores de resultado morte celular na liberação diminuída de 51 Cr. Como células efetoras, usamos uma população autoreactive ativado clonal de linfócitos CD8 + T citotóxicas (CTL) isolado de um camundongo transgênico estoque para ambas as cadeias alfa e beta do receptor de células T AI4 (TCR). Ativado AI4 células T foram co-cultivados com células-alvo 51 Cr rotulados NIT por 16 horas, a liberação de 51 Cr foi gravado para calcular a lise específica Mitocôndrias participar em muitos eventos fisiológicos importantes, como a produção de energia, regulação da transdução de sinalização e apoptose. O estudo da célula beta mitocondrial alterações funcionais durante o desenvolvimento do DM1 é uma área nova de pesquisa. Usando o potencial de membrana mitocondrial corante Rodamina Tetrametil Methyl Ester (TMRM) e imagens de células microscópicas confocal vivemos, nós monitorados potencial de membrana mitocondrial ao longo do tempo na linha da célula beta NIT-1. Para exames de imagem, AI4 células T efectoras foram marcadas com o corante fluorescente coloração nuclear Picogreen. NIT-1 e células T foram co-cultivados em câmaras lamínula e montado sobre o palco microscópio equipado com uma câmara de células vivas, a 37 ° C, com 5% de CO 2, e umidificado. Durante esses experimentos imagens foram tiradas de cada cluster a cada 3 minutos para 400 minutos. Mais de um curso de 400 minutos, observou-se a dissipação do potencial de membrana mitocondrial em NIT-1 grupos de células, onde AI4 células T foram anexados. No experimento controle simultâneo onde NIT-1 as células foram co-cultivados com MHC desencontradas células Jurkat linfócitos, potencial de membrana mitocondrial permaneceu intacta. Esta técnica pode ser usada para observar em tempo real as mudanças no potencial de membrana mitocondrial em células sob ataque de linfócitos citotóxicos, citocinas, ou outros reagentes citotóxicos.

Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados ​​para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

O diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune mediada por células T. Durante a patogênese, os pacientes tornam-se progressivamente mais insulinopênicos à medida que a insulina...

A diabetes tipo um é uma doença autoimune na qual as células beta pancreáticas produtoras de insulina são destruídas por linfócitos T autoreativos. Compreender os mecanismos envolvidos fornecerá subsídios para gerar uma cura eficaz para esta doença. Aqui, demonstram-se dois métodos para observar in vitro a destruição específica das células beta pancreáticas mediada por linfócitos T positivos para cd oito: um ensaio de citotoxicidade linfocitária mediada por células baseado em cromo 51, ou ensaio CML, e um ensaio CML visual, para ambos os métodos.Células T efetoras CD8 positivas são inicialmente preparadas a partir de baços de camundongos para realizar um ensaio de LMC. Células-beta alvo knit one ou knit four são marcadas com cromo 51 e co-cultivadas com células efetoras. Quando as células-beta alvo são destruídas, o cromo 51 é liberado. Os sobrenadantes e lisados celulares são então coletados e os níveis de radioatividade, que indicam o grau de morte celular, são medidos utilizando um contador gama para realizar um ensaio de LMC visual. Células-beta alvo knit one e knit four são marcadas com o corante de potencial mitocondrial TM RM, e células efetoras são marcadas com pico verde.As células são combinadas e é realizada a microscopia de células vivas para examinar a taxa de morte celular indicada pela dissipação do potencial da membrana mitocondrial. A principal vantagem deste ensaio em relação aos ensaios tradicionais, como o ensaio de liberação de cromo, é que podemos observar a morte de células beta em tempo real. Vantagens adicionais incluem a capacidade de determinar se a morte de células beta mediada por linfócitos T CD8 é dependente de contato, e também o fato de que este ensaio pode ser expandido com o uso de indicadores fluorescentes para mapear as vias de morte de células beta.Este método pode responder perguntas fundamentais na patogênese de qualquer doença em que linfócitos T citotóxicos desempenhem um papel. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia e possivelmente para o diagnóstico, pois a função mitocondrial é essencial tanto para a sobrevivência quanto para a fisiologia das células beta. Jing Chen e eu demonstraremos este procedimento.As células-alvo utilizadas nesta demonstração são as linhagens de células beta de camundongo, knit one e knit four, e a linhagem de linfócitos humanos CD três positivo, que não reconhece nem mata células beta de camundongo, sendo utilizada como controle negativo das células efetoras. Aqui estão as células T autoreativas CD oito positivas obtidas a partir dos baços de camundongos nod AI quatro alfa beta F1 com três a quatro semanas de idade. Para obter as células, comece colocando os baços em um homogeneizador de vidro de sete mililitros contendo cinco mililitros de HBSS gelado. Homogeneíze os baços utilizando um homogeneizador de Dounce, em seguida transfira a suspensão celular para um tubo cônico e centrifugue a 250 ×g durante cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante. Então, para remover os glóbulos vermelhos, ressuspenda o sedimento em cinco mililitros de solução hipotônica por baço. Incube por cinco minutos no gelo.Após a incubação, lave o pellet celular duas vezes com 10 mililitros de HBSS gelado, centrifugando. Entre cada lavagem, ressuspenda a suspensão celular em 10 mililitros de HBSS gelado. Em seguida, utilizando um hemocitômetro, conte as células após a determinação dos números celulares.Centrifugue novamente, então ressuspenda as células em RPMI 1640 suplementado numa densidade de cinco vezes 10 à sexta células por mililitro, semeando as células numa densidade de cinco vezes 10 à sexta por mililitro em um frasco T75. Por fim, para ativar as células, adicione AI quatro miópe e IL dois ao frasco em concentrações finais de 0,1 micromolar e 25 unidades por mililitro, respectivamente, e incube o frasco em uma incubadora com 5% de CO₂ a 37 graus Celsius por três dias. As células ativadas podem agora ser usadas para ensaio de LMC baseado em CRÔMIO 51 ou para um ensaio visual de LMC.O ensaio de citotoxicidade linfocitária mediada por células ou CML utiliza aqui a liberação de cromo-51 de células-alvo como indicador da morte de células beta mediada por CD8. Para marcar células-beta alvo NIT-1 ou NIT-4 com cromo-51, comece semeando-as numa densidade de 5 × 10⁴ células por poço de uma placa de 96 poços em 200 µL de DMEM suplementado, e incube a 37 °C e 5% CO₂ por 24 horas. No dia seguinte, dilua o cromo-51 em DMEM suplementado para uma concentração de um microcurie por 20 µL.Em seguida, adicione 20 microlitros do cromo 51 diluído a cada poço contendo as células-beta-alvo para obter um microcurie por poço. Coloque a placa em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO2 e incube por três horas após a incubação. Aspire o meio e lave as células três vezes com meio de cultura fresco.Em seguida, adicione meio às células efetoras CD8 positivas ativadas de forma que o volume final adicionado a cada poço seja de 200 microlitros. Combine as culturas de células efetoras e células-beta-alvo nas razões E:T desejadas aqui; razões de 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 e 0,25:1 são utilizadas para preparar os controles de lise espontânea. Adicione meio fresco a seis poços das células-beta-alvo.Em seguida, coloque a placa no incubador e co-cultive as células efetoras e-alvo por 16 horas. No dia seguinte, use uma pipeta multicanal para transferir o sobrenadante para seis tubos de vidro lime de 50 milímetros. Depois, adicione cem microlitros de SDS 2% à placa para lisar as células e pipete suavemente para cima e para baixo várias vezes.Transfira o lisado celular para um novo conjunto de seis tubos de vidro de cal de 50 milímetros. Em seguida, para garantir que todo o lisado celular seja coletado, adicione cem microlitros de água estéril em cada poço, pipetando para cima e para baixo, e adicione aos tubos de lisado celular para determinar o grau de destruição das células beta. Meça a radioatividade no sobrenadante e no lisado utilizando um contador gama após a realização das contagens.Determine a lise específica subtraindo a porcentagem de contagens nos sobrenadantes do controle de lise espontânea da porcentagem de contagens nos sobrenadantes experimentais, conforme mostrado nesta equação. Para examinar a morte de células beta mediada por linfócitos T em tempo real. O potencial da membrana mitocondrial é monitorado por meio de imagem em tempo real de culturas co-cultivadas de células-alvo e efetoras.Para preparar a microscopia, visualize as células-beta-alvo em lâminas de vidro com câmara de oito poços modificadas e esterilizadas, com cinco vezes 10 à quarta potência de células por poço. Coloque as lâminas em um incubador a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ e deixe as células crescerem por 48 horas. No dia do experimento, adicione o corante do potencial da membrana mitocondrial, metil éster da tetraetilrodamina (TMRM), a 25 nanomolares, e o meio DMEM suplementado livre de vermelho de fenol, e incube por 30 minutos.Uma vez que as células tenham sido coradas com TMRM, substitua o meio por meio fresco contendo cinco nanomolares de TM RM para manter a distribuição de equilíbrio do corante. Em seguida, conte as células T efetoras ativadas AI quatro ou as células controle jerk it utilizando um hemocitômetro, e re-suspenda as células em DMEM suplementado livre de vermelho de fenol em tubos cônicos de 15 mililitros na concentração apropriada. Em seguida, adicione pico verde às células efetoras ativadas ou às células controle jerk it até uma concentração final de um microlitro por mililitro.Envolva o tubo com papel alumínio para protegê-lo da luz, em seguida incube por cinco minutos à temperatura ambiente após a incubação. Lave as células três vezes adicionando DMEM sem vermelho de fenol, misturando brevemente e centrifugando a 250 ×g por cinco minutos. Para coletar as células para imagem, coloque a lâmina com câmara no estágio de um microscópio confocal equipado com estágio motorizado e câmara umidificada para imagem de células vivas a 37 graus Celsius e 5% CO₂.Adicione as células efetoras coradas com pico verde ativadas às câmaras na razão efetora por alvo a ser avaliada aqui. A razão ET filmada será de 50 para 1, configure o software de imagem para coletar imagens em quatro poços com três localizações cada, a cada três minutos, com 300 quadros por localização e excitação utilizando os conjuntos de filtros apropriados para TMRM e Pico Verde. Após a coleta de todas as imagens, elas devem ser convertidas para publicação aqui.Fiji e ImageJ são utilizados com um plugin de formatos bio da loci. Mais detalhes sobre a conversão de vídeo podem ser encontrados no texto escrito acompanhante. Um ensaio de citotoxicidade linfocítica mediada por células ou CML foi realizado utilizando cromo-51 conforme descrito neste vídeo.Como mostrado aqui, a porcentagem de lise específica mostrada no eixo Y aumenta à medida que a razão de efetores para alvos mostrada no eixo X aumenta. Para avaliar a morte celular por meio de imagem de células vivas, a linhagem de células beta murinas knit one foi corada com um corante de potencial de membrana mitocondrial, TMRM, mostrado em vermelho. Células T CD8 positivas autoreativas I4 ativadas foram coradas em verde com pico verde, e os dois tipos celulares foram cultivados em co-cultura numa razão E:T de 50:1, como pode ser observado aqui. O potencial de membrana mitocondrial das células knit one dissipou-se gradualmente durante um período de 400 minutos, mas apenas nos agregados que estavam interagindo com as células T I4 verdes. Como experimento controle, células knit one coradas foram cultivadas com células T humanas jerk, não compatíveis em MHC, coradas com pico verde, como pode ser visto aqui.Células knit one foram capazes de manter o potencial da membrana mitocondrial durante toda a duração de 400 minutos. Células circuite não interagiram com aglomerados de knit one e, portanto, não induziram a morte. Uma vez dominado.Essa técnica leva aproximadamente cinco dias, incluindo a preparação das células. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como o potencial da membrana da célula beta muda quando sob ataque por linfócitos T autoreativos. Não se esqueça de que trabalhar com radioisótopos pode ser perigoso e que o treinamento adequado deve ser obtido e precauções tomadas durante a realização deste procedimento.

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

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Um ensaio para avaliar a imunodominância nas respostas de linfócitos T citotóxicos

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O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

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