Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

O objetivo geral do procedimento a seguir é gerar rapidamente linfócitos T citotóxicos específicos para vírus, ou CTLs, derivados de doador, adequados para transferência adotiva a receptores alogênicos de transplante de células-tronco hematopoiéticas ou HSCT. Isso é alcançado primeiramente por nucleofecção de células dendríticas ou DCs com plasmídeos que codificam antígenos virais, para preparar as células para apresentação de antígenos. Como segundo passo, as DCs nucleofectadas são usadas para estimular linfócitos T específicos para antígenos, que então são expandidos na presença de IL-4 e IL-7 em um dispositivo de cultura permeável a gases chamado GRe.

Em seguida, após sete dias de cultivo, as células são divididas e repassadas e seu meio é reposto para manter a expansão máxima de LTC in vitro. Por fim, no dia 12, as células são colhidas e testadas quanto à pureza, potência e segurança e são criopreservadas para uso clínico posterior. Em última análise, linhagens de LTC com especificidade multiviral e reatividade alo mínima podem ser geradas, conforme evidenciado pela coloração intracelular de citocinas, produção de interferon gama e citotoxicidade.

O processo de fabricação de linhagens de células T citotóxicas multivirais específicas é demorado e trabalhoso. Requer o uso de linhagens de células B transformadas pelo vírus Epstein-Barr e vetores adenovirais, e o procedimento leva cerca de três meses. Nosso novo método não utiliza vetores virais.

As células crescem exponencialmente em cultura, com perda celular mínima, e, portanto, o procedimento é rápido e economicamente viável. Demonstrando este procedimento está Eureka Gerdeman, que é pesquisadora clínica no laboratório Harvest, monócitos derivados de DCs, que foram gerados em meio Cellgenic, suplementado com IL-4 e G-M-C-S-F, e então maturados por 24 horas em citocinas de maturação mediante ressuspensão suave com uma pipeta de transferência de três mililitros. Utilize tripano azul para contar os DCs e, em seguida, transfira-os para três tubos de 15 mililitros, com não menos de 0,5 × 10⁶ e não mais de 2 × 10⁶ células por tubo.

Em seguida, centrifugue o DCS por 10 minutos a 200 vezes G. Durante esse tempo, prepare seis mililitros de meio cell genix suplementado com o mesmo coquetel de citocinas de maturação de DC usado anteriormente e plaque dois mililitros em três poços de uma placa de cultura de tecidos com 12 poços. Preencha os poços não utilizados com dois mililitros de água estéril. Transfira a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de CO2 para pré-aquecimento.

Após a centrifugação das células, aspire os sobrenadantes e adicione os plasmídeos de DNA relevantes a cada tubo numa concentração final de cinco microgramas de DNA por tubo. Aqui, o plasmídeo que codifica IE um PP 65 está sendo adicionado ao tubo número um, heon penton ao tubo número dois e E BNA um LMP dois BZ F1 ao tubo número três reus. Suspenda as DCs e o DNA com 100 microlitros de solução de eletroporação.

Misture bem e transfira a mistura para cubetas NU de afeção nuclear. Coloque as cubetas no efetor nuclear D quatro. Escolha o programa CB um 50 e pressione iniciar imediatamente após a afeção nuclear.

Adicione 500 microlitros do meio de maturação PREWARM CELLGENIC DC a cada vete, misture as células pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes e transfira as DCs nucleofetadas para a placa de 12 poços preparada contendo os 1,5 mililitros restantes do meio de maturação DC pré-aquecido. Transfira a placa para o incubador por mais 12 a 18 horas, colha, conte e, em seguida, irradie as DCs nucleofetadas. Lave as células uma vez com 10 mililitros do meio CTL e, então, re-suspenda-as a três vezes 10 à quinta DCs por mililitro do meio. Reúna um mínimo de 7,5 vezes 10 à quinta, ou seja, 2,5 mililitros, e um máximo de 15 vezes 10 à quinta, ou seja, cinco mililitros, de DCs provenientes das três nucleofecções e transfira as DCs transfectadas com plasmídeo agrupadas para o dispositivo G Rex.

Em seguida, coloque o dispositivo na incubadora para o preparo das células responsivas. Utilize as células mononucleares não aderentes que permanecem após a seleção de DCs. Transfira os responsivos para a solução de cultura pré-aquecida.

Lave-os uma vez com meio CTL reus. Suspender as células em meio CTL. Contar as células e ajustá-las para uma concentração de duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Retire 15 vezes 10 elevado a seis células ou 7,5 mililitros e complemente com as citocinas IL-4 e IL-7. Transfira 7,5 mililitros de PBMC para o G Rex e complete o biorreator com meio CTL até um volume total de 30 mililitros. Por fim, coloque o G Rex na incubadora por seis a sete dias; no sexto a sétimo dia, aspire 10 mililitros do meio.

Em seguida, misture os 20 mililitros restantes de meio com uma pipeta de 10 mililitros. Use azul de tripano para contar as células se houver menos de 50 vezes 10 à sexta potência de células. Reponha o cultivo com meio fresco e citocinas.

Se houver mais de 50 vezes 10 à sexta células, remova 10 mililitros da suspensão celular, transfira as células para um novo G rex e, em seguida, alimente ambos os G rex com meio CTL fresco e citocinas, cultivando as células por mais quatro a seis dias para expandir o número suficiente de células, colha e conte as células. Em seguida, congele qualquer célula que não seja usada para análises fenotípicas ou funcionais para uso futuro. Resultados representativos mostram que plasmídeos de DNA multicitônicos induzem células T específicas para múltiplos vírus, conforme medido pelo ensaio de liberação de interferonogama e pela frequência de células reativas, sendo superiores às linhagens geradas usando plasmídeos PHU convencionais que expressam os mesmos antígenos.

A proporção ideal de DC para PBMC é importante para uma estimulação potente de linfócitos T, conforme mostrado nesta figura, onde uma proporção de um para 50 produz uma reativação subótima em comparação com uma proporção de um para 20 de células estimuladoras para células respondentes. O cultivo de CTL no G rex, como visto nesta figura, favorece uma expansão superior de linfócitos T em comparação com placas convencionais de 24 poços. A adição de IL-4 e IL-7 aos cultivos aumenta o repertório e a especificidade das células expandidas, conforme demonstrado aqui, onde a frequência de linfócitos T reativos contra o peptídeo NLV restrito ao HLA-A2 derivado da proteína PP65 do CMV foi avaliada em cultivos gerados na presença ou ausência de IL-4 e/ou IL-7. Esta figura mostra uma amostra representativa do fenótipo dos CTL multivirais rapidamente expandidos, que são policlonais, com uma mistura de linfócitos T CD4-positivos e CD8-positivos, dos quais a maioria expressa os marcadores de memória CD45RO e CD62L. Os CTL expandidos são específicos para todos os antígenos estimuladores e são polifuncionais, conforme avaliado aqui por coloração intracelular de citocinas para detectar a produção de interferonogama e TNF-alfa após estimulação antigênica, bem como avaliado pelo ensaio de liberação de cromo.

Os CTL expandidos são capazes de matar especificamente alvos virais, mas não apresentam atividade inespecífica contra alvos com incompatibilidade de HLA não virais, uma consideração crucial de segurança. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar rapidamente linhagens de células T citotóxicas multivirais específicas, compatíveis com GNP e adequadas para transferência adotiva em pacientes com doenças associadas a vírus. A simplificação deste procedimento deve facilitar sua extensão além das instalações especializadas de fabricação e permitir que o procedimento se torne padrão de tratamento para pacientes imunocomprometidos e altamente suscetíveis a doenças associadas a vírus.