Name: Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a gerar linfócitos T citotóxicos multivírus específicos para imunoterapia em receptores de transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico. Este protocolo rápido e compatível com BPF facilita a produção clínica.

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Este trabalho é apoiado por uma assistência de produção de terapias celulares (contrato NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), uma Centros Especializados de Terapia Celular Grant NIH-NHLBI uma U54 HL081007 (CMR), uma ASBMT Young Investigator Award (UG e JV), um Fellow da Sociedade Leucemia e Linfoma especial em Prêmio Pesquisa Clínica (UG), e uma Amy Strelzer Scholar Award Manasevit (AML).

1. Nucleofection DC <ol><li> Colheita derivados de monócitos DCs, que foram enriquecidas com a adesão de plástico, cultivadas por cinco dias usando celular Genix Mídia suplementado com IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) e ainda venceu por 24 horas usando a maturação citocinas IL4 DC (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml e PGE2 (1μg/ml) 1, pela ressuspensão gentil com uma pipeta de 3 ml. </li><li> Contar DCs viável usando azul de tripano, transferência para tubos 15ml 3x com nada menos que 0.5x10 6 e não mais do que 2x10 6 células / tubo. </li><li> Centrífuga DCs para 10mins @ 200g. Durante este período pré-aquecer celular Genix meio suplementado com as citocinas maturação DC (DC meios de maturação) - 2ml/well em três poços de uma cultura de tecidos de 12 bem tratado em uma placa de 37 ° C / 5% CO 2 incubadora. </li><li> Uma vez que células terminar spinning, aspirar o sobrenadante e adicionar os plasmídeos DNA relevantes para cada um dos tubos em uma concentração final de DNA 5μg / tubo. Neste caso, adicione o plasmídeo IE1-pp65 ao tubo n º 1, hexon-Penton ao tubo # 2, e EBNA1-LMP2-BZLF1 ao tubo n º 3. </li><li> Ressuspender DCs e DNA com 100μl de solução Amaxa nucloefection, misture bem e transferir para o cubetas nucleofection. </li><li> Cubetas lugar no nucleofector 4D, escolher programa CB150 (Amaxa / Lonza), e pressione o começo. </li><li> Imediatamente após nucleofection adicionar 500μl do 2ml pré-aquecido celular Genix meio de maturação DC para a cubeta, misturar suavemente por pipetagem cima e para baixo 2-3 vezes, e DCs nucleofected transferência para a chapa 12 bem preparados contendo os 1,5 ml restantes de pré-aquecida maturação media DC. Transferência para a 37 ° C / 5% CO 2 incubadora por mais 12-18hrs. </li></ol> 2. Estimulação das células T <ol><li> Colheita e contagem de DCs nucleofected, e irradiar a 30Gy. Lavar uma vez com 10ml de meio de CTL (45% RPMI, Cliques 45% EHAA, 10% FBS, 2mM Glutamax) e @ 3 ressuspender x 10 5 DCs por ml de mídia CTL. </li><li> Piscina um mínimo de 7.5x10 5 (2,5 ml) e um máximo de 15x10 5 (5ml) de DCs contendo cada um dos plasmídeos e transferir os DCs agrupados ao dispositivo G-Rex, que será então colocado na incubadora. </li><li> Para a preparação de células de resposta usar PBMCs anteriormente congelados ou não aderente células mononucleares que permanecem após a seleção DC (adesão ou CD14 seleção). Descongelar as células, a transferência para meio de cultura pré-aquecida, lave uma vez com a mídia CTL. Ressuspender as células em Media CTL, a contagem das células e levá-los a uma concentração de 2x10 6 células por ml. Leve 15x10 6 células ou 7.5ml e suplementar com 30000U IL4 (1000U/ml -. Conc final) e 300ng IL7 (10ng/ml - conc final.). </li><li> Transferência 7.5ml de PBMC (15x10 6 células) para o G-Rex e superior até o biorreator com a mídia CTL para um volume total de 30ml. </li><li> Cultura do G-Rex por 6-7 dias a 37 ° C / 5% CO 2 incubadora umidificada. </li></ol> 3. T expansão celular <ol><li> No dia 07/06, aspirar 10ml de mídia, então misturar as células do 20ml restantes de mídia com uma pipeta de 10 ml e contagem de células viáveis ​​com azul de tripano. Se houver &lt;50x10 6 repor com novas mídias + citocinas. Se houver&gt; 50x10 6 células remover 10ml de suspensão celular, a transferência para um novo G-Rex, e depois alimentar tanto G-Rexs com novas mídias CTL + citocinas. </li><li> Cultura para um adicional de 4-6 dias. Uma vez que células suficientes foram ampliados, realizar uma caracterização fenotípica e funcional do excesso de CTL e criopreservar para uso futuro. </li></ol> 4. Resultados representativos: Um esquema de nosso FDA-approved processo de geração de multivirus específicas CTL é mostrado na Figura 1. Em contraste com protocolos convenção multivirus CTL que usam adenovectors e EBV-LCL para estimular as células-vírus reativa T 2 temos substituído material de vírus infeccioso com plasmídeos DNA que codificam antígenos derivados de cada um dos três vírus. Para estimular a CTL trivirus nós projetamos três multicistronic plasmídeos codificando hexon e Penton de adenovírus, IE1 e pp65 do CMV, e EBNA1, LMP2, e BZLF1 de EBV. Estes antígenos foram escolhidos com base em resultados encorajadores clínica de nossas próprias e de outros grupos mostrando que as células T dirigidos contra Adv-hexon e Penton 2,4-6, e CMV-1E1 e CMV pp65-são protetores in vivo 7. Para EBV, EBNA1 é um CD4 + T imunodominantes antígeno alvo celular expressa em todas as neoplasias malignas associadas ao EBV e em células normais infectadas pelo EBV B 8,9, LMP2 é imunogênica em vários tipos de HLA múltiplas e expressa na maioria dos tumores malignos EBV, 10,11 enquanto BZLF1 codifica uma imunodominantes, antígeno precoce imediato ciclo lítico que estimula tanto CD4 + e CD8 + T da maioria dos indivíduos e é provável que importantes para o control de células replicação do vírus 12. Para otimizar ainda mais os nossos métodos de fabricação que colaborou com Tecnologia Nature que gerou minimizado, sem antibiótico (FDA-compliant) plasmídeos para a estimulação CTL 13,14. Usando esta estratégia que consistentemente alcançar eficiências nucleofection de&gt; 35%, mantendo a viabilidade das células de alta (dados não mostrados) 3. A Figura 2 mostra que a freqüência de células T-vírus específico em resposta a cosmídeos otimizado medida pelo IFNγ ELISPOT, foi maior que em resposta a convencional plasmídeos pShuttle baseado expressão expressando os mesmos antígenos (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV e EBV n = 2). O melhor rácio de DC: PBMC foi importante para a estimulação das células T potente como mostrado na Figura 3, onde uma proporção de 1:50 produzidos sub-ótimo de ativação em comparação com um S 1:20: R ratio (n = 2 doadores). Produção de suficientes números CTL com a especificidade do antígeno larga é um pré-requisito para a eficácia clínica contra os três vírus. Isto é conseguido pela cultura CTL no G-Rex, que apóia a expansão de células T superiores quando comparados com os placas de 24 poços (Figura 4A) 15, enquanto a adição de IL4 e IL7 a aumentos culturas do repertório e especificidade, como mostrado na Figura 4B onde a freqüência de células T reativas contra o CMV-pp65 derivados HLA-A2 RESTRIÇÕES NLV peptídeo foi avaliada em culturas gerado na presença ou ausência de IL4 e / ou IL7 16,17. Para avaliar a capacidade fenótipo e funcional das células expandidas realizamos análise de citometria de fluxo, intracelular de citocinas coloração / IFNγ ELISPOT, e 51 testes de liberação de Cr sobre o produto final para a criopreservação / perfusão. Normalmente as células geradas são policlonais com uma população mista de células CD4 + e CD8 + T com antígeno especificidade detectáveis ​​nos dois compartimentos da célula T. O CTL são capazes de matar antígeno viral expressando as células-alvo, mas não do vírus negativos parcialmente HLA alvos combinados, indicando que eles não devem induzir enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) in vivo (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rctl protocolo geração. Primeiro, DCs são nucleofected com o antígeno viral codificação de plasmídeos e então misturado com PBMCs autólogo em um R: S de 10 ou 20:1. Células são expandidas no G-Rex por 10-14 dias, na presença de IL4 e IL7, então colhidos, contados, testado para a identidade de função, e esterilidade, e depois criopreservados para uso clínico. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cosmídeos Optimized induzem ativação de células T in vitro superiores. DCs foram nucleofected com otimizado, FDA-compliant plasmídeos codificando hexon e Penton (Adv), IE1 e pp65 (CMV), e EBNA1, LMP2, e BZLF1 (EBV) ou plasmídeos pShuttle convencionais de codificação os mesmos antígenos. Estes foram usados ​​para estimular as células T e especificidade foi analisada pelo IFNγ ELISPOT 10 dias pós-estimulação. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 DC ideal:. Proporções de células T para a ativação do CTL. DCs de 2 doadores foram nucleofected com todos os três plasmídeos otimizado e, em seguida, utilizado para estimular PBMCs autólogo em 1:20 ou 1:50 DC: relação de PBMC. A freqüência de células T reativada foi avaliada no dia 10 de IFNγ ELISPOT. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Expansão de células T no G-Rex usando citocinas melhorando. Um painel mostra o dispositivo G-Rex, bem como aparência CTL na membrana gás permeável, avaliados por microscopia. Uma comparação entre a saída de células alcançado na convenção de cultura de tecidos tratados placas vs G-Rex também é mostrada. Painel B mostra a freqüência de CMV CTL pentâmero positivos alcançados nas culturas expandiu na presença de nenhum de citocinas, IL4 sozinho, IL7 sozinho e IL4 + IL7. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Fenótipo e função de CTL expandida. Um painel mostra um exemplo representativo do fenótipo do CTL multivirus expandido, que são policlonais com uma mistura de CD4 + (45% - helper) e CD8 + (42% - citotóxicos), as células T, dos quais a maioria (95%) expressou o memória marcador CD45RO + / CD62L + Panel. B mostra que essas células são específicos para todos os antígenos estimulante e são polifuncionais, avaliada pela coloração de citocinas intracelulares para detectar a produção de IFNΓ e TNFa após a estimulação antigênica. Painel C mostra que a CTL expandida são funcionais medida por Cr ensaio 51. Autólogo LCL, sozinho ou transduzidas com um vetor nulo ou um vetor adenoviral expressando-CMV pp65 foram usados ​​como alcatrãofica. Alloreactivity foi avaliada através explosões alogênico PHA como um alvo.

<ol><li>Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+producing+capacity+as+markers+of+function%3A+a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale.</a> J Immunother. 31, 359-369 (2008).</li>
<li>Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).</li>
<li>Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+DCs+to+generate+Multivirus-specific+T+cells+for+prevention+or+treatment+of+viral+infections+in+the+immunocompromised+host%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host.</a> Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).</li>
<li>Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hexon-specific+CD4+and+CD8+T-cell+epitopes+for+vaccine+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy.</a> J Virol. 82, 546-554 (2008).</li>
<li>Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+therapy+with+donor+T+cells+prevents+and+treats+adenovirus+and+Epstein-Barr+virus+infections+after+haploidentical+and+matched+unrelated+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.</a> Blood. 114, 4283-4292 (2009).</li>
<li>Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+adoptive+transfer+of+virus-specific+T-cell+immunity+for+the+treatment+of+systemic+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).</li>
<li>Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+cytomegalovirus+after+transplantation+is+correlated+with+immediate+early+1-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells.</a> J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).</li>
<li>Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immunogenicity+of+Epstein-Barr+virus+latent-cycle+proteins+for+human+CD4%28%2B%29+T-helper+1+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses.</a> J Virol. 75, 8649-8659 (2001).</li>
<li>Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBNA1-specific+CD4%2B+T+cells+in+healthy+carriers+of+Epstein-Barr+virus+are+primarily+Th1+in+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function.</a> J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).</li>
<li>Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+latent+membrane+protein+2+specificity+in+CTL+lines+from+patients+with+EBV-positive+nasopharyngeal+carcinoma+and+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma.</a> J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).</li>
<li>Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+responses+to+viral+infection+in+humans%3A+lessons+from+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).</li>
<li>Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+early+and+early+lytic+cycle+proteins+are+frequent+targets+of+the+Epstein-Barr+virus-induced+cytotoxic+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response.</a> J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).</li>
<li>Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+antibiotic-free+DNA+vaccine+vectors+utilizing+a+novel+RNA+based+plasmid+selection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system.</a> Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).</li>
<li>Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pDNAVACCultra+vector+family%3A+high+throughput+intracellular+targeting+DNA+vaccine+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids.</a> Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).</li>
<li>Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T-cells+for+pre-clinical+and+clinical+applications+using+Gas-permeable+Rapid+Expansion+cultureware+%28G-Rex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex.</a> Journal of Immunotherapy. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-induced+survival+of+activated+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).</li>
<li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+%28IL-4%29+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells%3A+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).</li>
<li>Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+restoration+of+immunity+against+Epstein-Barr+virus+infection+by+adoptive+transfer+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes.</a> Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).</li>
<li>Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes+to+control+Epstein-Barr+virus-related+lymphoproliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation.</a> Lancet. 345, 9-13 (1995).</li>
<li>Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+cytomegalovirus+%28CMV%29-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916-3922 (2002).</li>
<li>Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).</li>
</ol>

Juan F. Vera é um consultor de Wilson Manufacturing Wolf. Os outros autores não têm divulgações relevantes.

Infecções virais são responsáveis ​​por significativa morbidade e mortalidade em pacientes que são imunocomprometidos por sua doença ou seu tratamento. Após o transplante, por exemplo, infecções causadas por herpesvírus persistentes, como EBV e CMV, bem como por vírus respiratórios, tais como Vírus Sincicial Respiratório (VSR), são bem conhecidos, enquanto a importância de infecções causadas por Adv, vírus BK, e humanos herpesvirus (HHV) -6 tem mais recentemente sido apreciado. Enquanto agentes farmacológicos são a terapia padrão para algumas infecções, eles têm toxicidade substancial, gerar variantes resistentes, e são frequentemente ineficazes. Em contraste, as células T-vírus específicos derivados de doadores de células-tronco se mostraram seguros e eficazes para a prevenção e tratamento da infecção viral ou doença no transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) definição 2,5,6,18-21. No entanto, a mais ampla implementação de T imunoterapia celular é finalmente limitado pelo custo, complexidade e tempo necessário para a produção de CTL. Nosso romance e uma abordagem rápida para gerar multivirus CTL, descrito no manuscrito atual, deve aumentar substancialmente a possibilidade de terapia com células T citotóxicas para doenças virais, permitindo que a estratégia para se tornar um padrão de atendimento para o hospedeiro imunocomprometido. O uso de plasmídeos DCs nucleofected como APCs permite apresentação de antígenos em ambos MHC classe I e II sem a concorrência de vetores virais ou mesmo de vários antígenos virais sendo expresso em uma única célula desde diferentes populações DC são utilizados para cada três plasmídeo. O uso de IL-4 / 7 aumenta a sobrevida das células T e proliferação, o que ajuda a aumentar correspondentemente a freqüência eo repertório de responder células T antígeno-específicos 16,17. Finalmente, a cultura no G-Rex reduz drasticamente a apoptose de células T durante a cultura. Troca gasosa (O 2 e CO 2) ocorre através de uma membrana de silício de gás permeáveis ​​na base do frasco, evitando a hipóxia, permitindo uma maior profundidade de médio acima das células, fornecendo mais nutrientes e diluição de resíduos. Esta plataforma também pode ser estendido aos vírus adicionais como quando antígenos protetores são identificados.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R + D Systems </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> Peprotech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> AB soro humano </td><td> Vale Biomedical Inc. </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> AAF-1001B &amp; AAF-1001X </td></tr><tr><td> Kit Nucleofection </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP-3012 </td></tr><tr><td> Plasmídeos </td><td> NTC </td><td> n / a </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> R &amp; D </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R &amp; D </td><td> LB-201-025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R &amp; D </td><td> 206-IL-CF </td></tr><tr><td> TNFa </td><td> R &amp; D </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> Sigma </td><td> P6532-1MG </td></tr><tr><td> G-Rex </td><td> Wilson Lobo Manufacturing </td><td> AY11-00027 </td></tr></tbody></table>

geração de células t específicas multivirus para prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Infecções virais causar morbidade e mortalidade em transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (TCTH) destinatários. Nós e os outros têm gerado com sucesso e infundida células T específicas para Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV) e adenovírus (Adv), utilizando monócitos e células EBV-transformadas linfoblastóides (EBV-LCL) gene modificado com um vetor de adenovírus como células apresentadoras de antígenos (APCs). Sómente 2x10 5 / kg trivirus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) proliferaram por vários registros após a infusão e apareceu para prevenir e tratar a doença viral grave ainda resistentes a outras terapias disponíveis. Quanto mais ampla a implementação desta abordagem é limitada pela encorajando altos custos de produção, a complexidade de produção e tempo prolongado (4-6 semanas para EBV-LCL geração, e 4-8 semanas para a fabricação de CTL - total 10-14 semanas) para a preparação. Para superar essas limitações, temos desenvolvido um novo protocolo de GMP-compliant produção CTL. Em primeiro lugar, no lugar de adenovectors para estimular as células T que usamos células dendríticas (DCs) nucleofected com DNA de codificação de plasmídeos LMP2, EBNA1 e BZLF1 (EBV), hexon e Penton (Adv), e pp65 e IE1 (CMV), como apresentadoras de antígenos células. Estes APCs reativar células T específicas para todos os antígenos estimulante. Cultura, segundo células T ativadas na presença de IL-4 (1000 U / ml) e IL-7 (10ng/ml) aumenta e sustenta o repertório ea freqüência de células T específicas em nossas linhas. Terceiro, temos utilizado um novo dispositivo de cultura de gás permeável (G-Rex), que promove a expansão ea sobrevivência de números de grandes células, após um estímulo único, eliminando assim a necessidade de EBV-LCLS e reduzindo a intervenção do técnico. Ao implementar essas mudanças nós podemos agora produzir CTL multiespecífico segmentação EBV, CMV, e Adv, a um custo por 10 6 células que é reduzida em&gt; 90%, e em apenas 10 dias em vez de 10 semanas, utilizando uma abordagem que pode ser alargado a mais proteção antígenos virais. Nossa abordagem FDA-approved deve ser de valor para aplicações profiláticas e de tratamento para os destinatários de alto risco HSCT alogênico.

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Infecções virais causam morbidade e mortalidade em receptores de transplante alogênico de células-tronco hematopoéticas (TCTH). Nós e outros pesquisadores conseguimos...

O objetivo geral do procedimento a seguir é gerar rapidamente linfócitos T citotóxicos específicos para vírus, ou CTLs, derivados de doador, adequados para transferência adotiva a receptores alogênicos de transplante de células-tronco hematopoiéticas ou HSCT. Isso é alcançado primeiramente por nucleofecção de células dendríticas ou DCs com plasmídeos que codificam antígenos virais, para preparar as células para apresentação de antígenos. Como segundo passo, as DCs nucleofectadas são usadas para estimular linfócitos T específicos para antígenos, que então são expandidos na presença de IL-4 e IL-7 em um dispositivo de cultura permeável a gases chamado GRe.Em seguida, após sete dias de cultivo, as células são divididas e repassadas e seu meio é reposto para manter a expansão máxima de LTC in vitro. Por fim, no dia 12, as células são colhidas e testadas quanto à pureza, potência e segurança e são criopreservadas para uso clínico posterior. Em última análise, linhagens de LTC com especificidade multiviral e reatividade alo mínima podem ser geradas, conforme evidenciado pela coloração intracelular de citocinas, produção de interferon gama e citotoxicidade.O processo de fabricação de linhagens de células T citotóxicas multivirais específicas é demorado e trabalhoso. Requer o uso de linhagens de células B transformadas pelo vírus Epstein-Barr e vetores adenovirais, e o procedimento leva cerca de três meses. Nosso novo método não utiliza vetores virais.As células crescem exponencialmente em cultura, com perda celular mínima, e, portanto, o procedimento é rápido e economicamente viável. Demonstrando este procedimento está Eureka Gerdeman, que é pesquisadora clínica no laboratório Harvest, monócitos derivados de DCs, que foram gerados em meio Cellgenic, suplementado com IL-4 e G-M-C-S-F, e então maturados por 24 horas em citocinas de maturação mediante ressuspensão suave com uma pipeta de transferência de três mililitros. Utilize tripano azul para contar os DCs e, em seguida, transfira-os para três tubos de 15 mililitros, com não menos de 0,5 × 10⁶ e não mais de 2 × 10⁶ células por tubo.Em seguida, centrifugue o DCS por 10 minutos a 200 vezes G. Durante esse tempo, prepare seis mililitros de meio cell genix suplementado com o mesmo coquetel de citocinas de maturação de DC usado anteriormente e plaque dois mililitros em três poços de uma placa de cultura de tecidos com 12 poços. Preencha os poços não utilizados com dois mililitros de água estéril. Transfira a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de CO2 para pré-aquecimento.Após a centrifugação das células, aspire os sobrenadantes e adicione os plasmídeos de DNA relevantes a cada tubo numa concentração final de cinco microgramas de DNA por tubo. Aqui, o plasmídeo que codifica IE um PP 65 está sendo adicionado ao tubo número um, heon penton ao tubo número dois e E BNA um LMP dois BZ F1 ao tubo número três reus. Suspenda as DCs e o DNA com 100 microlitros de solução de eletroporação.Misture bem e transfira a mistura para cubetas NU de afeção nuclear. Coloque as cubetas no efetor nuclear D quatro. Escolha o programa CB um 50 e pressione iniciar imediatamente após a afeção nuclear.Adicione 500 microlitros do meio de maturação PREWARM CELLGENIC DC a cada vete, misture as células pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes e transfira as DCs nucleofetadas para a placa de 12 poços preparada contendo os 1,5 mililitros restantes do meio de maturação DC pré-aquecido. Transfira a placa para o incubador por mais 12 a 18 horas, colha, conte e, em seguida, irradie as DCs nucleofetadas. Lave as células uma vez com 10 mililitros do meio CTL e, então, re-suspenda-as a três vezes 10 à quinta DCs por mililitro do meio. Reúna um mínimo de 7,5 vezes 10 à quinta, ou seja, 2,5 mililitros, e um máximo de 15 vezes 10 à quinta, ou seja, cinco mililitros, de DCs provenientes das três nucleofecções e transfira as DCs transfectadas com plasmídeo agrupadas para o dispositivo G Rex.Em seguida, coloque o dispositivo na incubadora para o preparo das células responsivas. Utilize as células mononucleares não aderentes que permanecem após a seleção de DCs. Transfira os responsivos para a solução de cultura pré-aquecida.Lave-os uma vez com meio CTL reus. Suspender as células em meio CTL. Contar as células e ajustá-las para uma concentração de duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro.Retire 15 vezes 10 elevado a seis células ou 7,5 mililitros e complemente com as citocinas IL-4 e IL-7. Transfira 7,5 mililitros de PBMC para o G Rex e complete o biorreator com meio CTL até um volume total de 30 mililitros. Por fim, coloque o G Rex na incubadora por seis a sete dias; no sexto a sétimo dia, aspire 10 mililitros do meio.Em seguida, misture os 20 mililitros restantes de meio com uma pipeta de 10 mililitros. Use azul de tripano para contar as células se houver menos de 50 vezes 10 à sexta potência de células. Reponha o cultivo com meio fresco e citocinas.Se houver mais de 50 vezes 10 à sexta células, remova 10 mililitros da suspensão celular, transfira as células para um novo G rex e, em seguida, alimente ambos os G rex com meio CTL fresco e citocinas, cultivando as células por mais quatro a seis dias para expandir o número suficiente de células, colha e conte as células. Em seguida, congele qualquer célula que não seja usada para análises fenotípicas ou funcionais para uso futuro. Resultados representativos mostram que plasmídeos de DNA multicitônicos induzem células T específicas para múltiplos vírus, conforme medido pelo ensaio de liberação de interferonogama e pela frequência de células reativas, sendo superiores às linhagens geradas usando plasmídeos PHU convencionais que expressam os mesmos antígenos.A proporção ideal de DC para PBMC é importante para uma estimulação potente de linfócitos T, conforme mostrado nesta figura, onde uma proporção de um para 50 produz uma reativação subótima em comparação com uma proporção de um para 20 de células estimuladoras para células respondentes. O cultivo de CTL no G rex, como visto nesta figura, favorece uma expansão superior de linfócitos T em comparação com placas convencionais de 24 poços. A adição de IL-4 e IL-7 aos cultivos aumenta o repertório e a especificidade das células expandidas, conforme demonstrado aqui, onde a frequência de linfócitos T reativos contra o peptídeo NLV restrito ao HLA-A2 derivado da proteína PP65 do CMV foi avaliada em cultivos gerados na presença ou ausência de IL-4 e/ou IL-7. Esta figura mostra uma amostra representativa do fenótipo dos CTL multivirais rapidamente expandidos, que são policlonais, com uma mistura de linfócitos T CD4-positivos e CD8-positivos, dos quais a maioria expressa os marcadores de memória CD45RO e CD62L. Os CTL expandidos são específicos para todos os antígenos estimuladores e são polifuncionais, conforme avaliado aqui por coloração intracelular de citocinas para detectar a produção de interferonogama e TNF-alfa após estimulação antigênica, bem como avaliado pelo ensaio de liberação de cromo.Os CTL expandidos são capazes de matar especificamente alvos virais, mas não apresentam atividade inespecífica contra alvos com incompatibilidade de HLA não virais, uma consideração crucial de segurança. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar rapidamente linhagens de células T citotóxicas multivirais específicas, compatíveis com GNP e adequadas para transferência adotiva em pacientes com doenças associadas a vírus. A simplificação deste procedimento deve facilitar sua extensão além das instalações especializadas de fabricação e permitir que o procedimento se torne padrão de tratamento para pacientes imunocomprometidos e altamente suscetíveis a doenças associadas a vírus.

generation-multivirus-specific-t-cells-to-preventtreat-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve uma técnica simples para induzir aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico. A técnica pode ser aplicada clinicamente para gerar células não-alorreativas doador. Infusão dessas células poderia melhorar a reconstituição imunológica e reduzir a toxicidade após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

Aqui descrevemos a prática de fabricação primeiro (BPF) compatível com método de produção de vírus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) de sangue de cordão umbilical, fonte de células T predominantemente ingênua.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

O vídeo demonstra um ensaio usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) Essas células T, projetadas com receptores específicos do HBV, são transferidas para camundongos transgênicos. Os plasmídeos do genoma do HBV competentes para replicação são então injetados diretamente no fígado, permitindo a captação do DNA viral. Uma vez que os antígenos virais são expressos e apresentados por moléculas híbridas de MHC-I, as células T modificadas reconhecem e se ligam a esses...

Suprimindo a replicação do vírus da hepatite B usando células T específicas do antígeno viral

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Este artigo descreve um método para a geração e propagação de clones de células T humanas que respondem especificamente a um aloantígeno definido. Este protocolo pode ser adaptado para clonagem de células T humanas específicas para uma variedade de ligantes peptídicos-MHC.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

O objetivo deste protocolo é fabricar células T de grau clínico específicas para patógenos usando um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração automatizado de bancada que incorpora um sistema fechado de captura de citocinas e não requer equipe dedicada ou uso de uma instalação GMP. As células T específicas do citomegalovírus pp65 geradas podem ser administradas diretamente aos pacientes.

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Aprenda a gerar linfócitos T citotóxicos multivírus específicos para imunoterapia em receptores de transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico. Este protocolo rápido e compatível com BPF facilita a produção clínica.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

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