Name: A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a quantificar a capacidade de neutralização de autoanticorpos GM-CSF usando um ensaio de ligação livre de células com SGMR alfa recombinante. Este método oferece alta reprodutibilidade para pesquisa imunológica.

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Estamos muito gratos a K. Nakagaki, H. Dr. Ishii, Dr. K. Suzuki, Yamagata A., K. Oofusa por suas valiosas contribuições.

1. Produção e purificação de sGMRα <ol><li> Amplificar cDNA de sGMRα da biblioteca de cDNA placenta humana por reação em cadeia da polimerase (PCR). </li><li> Adicionar 50 base de 5'-UTR seqüência de final poliedrina baculovírus e 27 RGS base de codificação Sua tag-de-final 3 'do fragmento amplificado pela PCR por outro PCR. </li><li> Inserir o produto amplificado de PCR em um pMSG1.1MG plasmídeo. </li><li> Injetar o psGMR/M1.1MG construir com o vetor helper pHA3PIG em ovos de bicho-da-tensão pnd-w1. </li><li> Traseira do chocados G0 larvas às traças a 25 ° C. Tela de embriões obtidos por meio de cruzamentos G1 entre irmãos ou com pnd-w1 para a expressão MGFP nos olhos para obter transgênicos bichos tendo o gene sGMRα. </li><li> Extrato recombinante sGMRα dos casulos de bicho-da-transgênicos com tampão fosfato contendo 500mM NaCl e mexa a 4 ° C por 24h. </li><li> Centrífuga de amostra em 20.000 g por 15 min para remover um precipitados. </li><li> Aplicar o sobrenadante para uma coluna de níquel afinidade. </li><li> Lavar a coluna com 10mM imidazol, NaCl 500mM e fosfato de sódio 20mM, pH6.3, e eluir com um gradiente linear de imidazol de 10mm a 250mm. Piscina as frações contendo o sGMRα purificado e diálise contra tampão fosfato (pH7.4) (PBS). </li></ol> 2. Biotinilação de GM-CSF recombinante <ol><li> Remover preparação sorbitol por diálise contra PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de sódio 20mM frio meta-periodato a 4 ° C para a solução em gelo. </li><li> Incubar a amostra por 30min no gelo no escuro. </li><li> Adicionar glicerol para a solução em uma concentração final de 15mM. </li><li> Diálise a solução contra tampão acetato de sódio 100mM (pH5.5) </li><li> Adicionar biotina hidrazida para a solução em uma concentração final de 5mM e continuamente agitar a solução para 2h em temperatura ambiente. </li><li> Remover o material não reagiu por diálise contra PBS, pH7.4. </li></ol> 3. Uma célula-livre GM-CSF receptor-ligand-binding ensaio <ol><li> Placa de um casaco de microtitulação com 50μl de anticorpo monoclonal anti-polyHistidine overnight a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 100μl de uma solução de bloqueio e incubar por 3h a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 50μl de sGMRα na solução de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 25μl das amostras contendo GM-CSF auto-anticorpos e, em seguida, 25μl de biotinilado GM-CSF. Incubar por 1h a 4 ° C para formar sGMRα-GM-CSF complexo. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 50μl de 0.4mm fosfatase alcalina estreptavidina para uma hora a 4 ° C para detectar a biotinilado GM-CSF ligado sGMRα. </li><li> Lavar cinco vezes com 500μl de PBST. </li><li> Adicionar 50μl de um substrato quimioluminescente para a solução e incubados por 1h em temperatura ambiente. </li><li> Usando um leitor de placas de quimioluminescência, detectar a atividade quimioluminescência. </li></ol> 4. Resultados representativos: O primeiro passo para a GM-CSF via de transdução de sinal receptor é a ligação do GM-CSF a GM-CSF alpha receptor na superfície da célula. Porque a GM-CSF auto-anticorpos se liga especificamente GM-CSF e bloquear a sua ligação ao receptor in vitro 16,17, temos a hipótese de que os auto-anticorpos inibem esta primeira reação diretamente ligação a GM-CSF. Como descrito anteriormente (Ref. 15/09), foi aplicado transgênicos tecnologia-da-seda para obter uma grande quantidade de sGMRα recombinante com alta pureza. Quando o bicho derivados sGMRα recombinante foi carregado no SDS-PAGE em condições não-condições redutoras, o sGMRα mostrou tanto monomérica (45 kDa) e dimérica (90 kDa) formas, enquanto que apenas a forma monomérica foi detectado em condições redutoras (Figura 1B) , indicando que o sGMRα recombinante foi uma mistura de monômeros e dissulfeto-linked dimmers 18. Utilizando o sistema de células livres (Fig. 2A), avaliou-se a inibição da GM-CSF ligação a sGMRα pela GM-CSF auto-anticorpos (Fig. 2B e Figura. 2C). Estes métodos foram descritos na referência 19 por Urano et al. A inibição do crescimento foi estreitamente relacionado com a inibição de ligação (r = 0,988, p = 0,002) em várias concentrações dos auto-anticorpos GM-CSF (Fig. 3A) 19. Da mesma forma, a inibição de ligação foi significativamente correlacionada com a inibição do crescimento. A inibição de ligação aumentou de forma dose-dependente pela GM-CSF auto-anticorpos (Fig. 3B) 19. Estes dois parâmetros para as frações de soro IgG de diferentes pacientes foram correlacionados entre si (r = 0,589 p = 0,006, fig. 3C). Nem a inibição de ligação, nem a inibição do crescimento correlacionado com os valores de Kd, e assim, ambos os parâmetros não foram afetados pela afinidade de ligação 19. Consequentemente, reprodutibilidade de dados entre vinculativo e gCRESCIMENTO inibição obtidos através três experimentos independentes em três diferentes amostras foi avaliada. O coeficiente de variação indicou que o sistema livre de células foi mais excelente do que o de bioensaio (tabela 1). <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma do procedimento para a produção de transgênicos sGMRα usando bichos. A) As estruturas dos vetores de transformação 9-11. B) SDS-PAGE e coloração Coomassie Brilliant Blue-do sGMRα purificada sob redutores e não redutores condições. sGMRα, solúvel GM-CSF receptor alfa; MGFP, monstro proteína verde fluorescente; BmNPVpol5'-UTR, 5'-não traduzida seqüência região de Bombyx mori poliedrose nuclear vírus poliedrina; polyA SV40, SV40 seqüência de sinal polyA; P 3xP3, 3xP3 promotor; P SER1, SER1 promotor; FIBL polyA, fibroína L de cadeia seqüência de sinal polyA; hr3, Bombyx mori vírus da poliedrose nuclear hr3 enhancer. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esquema do sistema de ensaio livre de células. A) Um ensaio de ligação competitiva utilizando sGMRα produzido pelo bicho da seda. B) Efeito de anticorpos neutralizantes e não-neutralizantes na inibição de ligação por celular sem sistema. C) A diferença de inibição de ligação entre várias concentrações de anticorpos neutralizantes e não-anticorpos neutralizantes. GM-CSF, estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos fator; sGMRα, solúvel GM-CSF receptor alfa; Sua, RGS-His-tag, AP, fosfatase alcalina. <img src="/files/ftp_upload/2742/2742fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. GM-CSF inibição de ligação para sGMRα por efeito de GM-CSF anticorpos policlonais ou frações de soro IgG de pacientes com PAP auto-imunes. A) Relação entre a inibição de ligação e inibição do crescimento por GM-CSF auto-anticorpos. B) inibição Binding em várias concentrações de GM-CSF auto-anticorpos. C) Relação entre IC 50 por cento para a inibição da ligação e inibição do crescimento por cento em frações de soro IgG 19. IC 50, 50% da concentração inibitória; GM-CSF, granulócitos e macrófagos fator estimulante de colônia. <table border="1"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> A </td><td> B </td><td> C </td></tr><tr><td colspan="4"> Inter-ensaio </td></tr><tr><td> # Das determinações </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Valor médio (% de inibição de ligação) </td><td> 61,6 </td><td> 63,8 </td><td> 69,7 </td></tr><tr><td> Valor médio (inibição do crescimento%) </td><td> 21,0 </td><td> 73,4 </td><td> 82,8 </td></tr><tr><td> Coeficiente de variação (%) (% de inibição de ligação) </td><td> 6 </td><td> 5,6 </td><td> 8,3 </td></tr><tr><td> Coeficiente de variação (%) (inibição do crescimento%) </td><td> 64,4 </td><td> 18,3 </td><td> 10,4 </td></tr></tbody></table> Ambos os ensaios foram realizados em 5 ng / ml de GM-CSF e uma concentração igual a GM-CSF auto-anticorpos. Tabela 1. Comparação de coeficiente de variação entre vinculativo por cento e as inibições de crescimento obtidos através de três experimentos independentes.

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</ol>

O ensaio livre de células estimou a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade e rapidez. A inibição de ligação por auto-anticorpos GM-CSF ou frações de soro do paciente IgG foi avaliada por este ensaio. Os dados mostraram uma correlação entre a inibição de ligação do ensaio livre de células ea inibição do crescimento de um bioensaio utilizando células TF-1, respectivamente. O bioensaio tem sido amplamente utilizada, mas abrigava dificuldades na comparação de dados entre difere...

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A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

FUNDOS: Anteriormente, demonstramos que a capacidade de neutralizar, mas não a concentração de GM-CSF auto-anticorpos foi correlacionada com a severidade da doença em pacientes com proteinose alveolar pulmonar auto-imunes (PAP) 1-3. Como revogação da GM-CSF bioatividade no pulmão é a causa mais provável para PAP auto-imunes 4,5, é promissora para medir a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos para avaliar a gravidade da doença em cada paciente com PAP. Até agora, a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos foi avaliada através da avaliação da inibição do crescimento de células de medula óssea humana ou TF-1 células estimuladas com GM-CSF 6-8. No sistema de bioensaio, no entanto, muitas vezes é problemático para obter dados fiáveis, bem como comparar os dados de diferentes laboratórios, devido a dificuldades técnicas na manutenção das células em uma condição constante. OBJETIVO: Para imitar GM-CSF ligação ao GM-CSF receptor na superfície celular utilizando células livres receptor-ensaio de ligação. MÉTODOS: Transgênicos bicho-da-tecnologia foi aplicada para a obtenção de uma grande quantidade de recombinante solúvel GM-CSF receptor alfa (sGMRα) com alta pureza 9-13. O sGMRα recombinante foi contido nas camadas sericin hidrofílica de fios de seda sem ser fundida ao proteínas da seda, e assim, podemos facilmente extrair os casulos na pureza bom com soluções aquosas neutras 14,15. Felizmente, as estruturas de oligossacarídeos, que são críticos para a ligação com a GM-CSF, são mais semelhantes às estruturas de sGMRα humana do que aquelas produzidas por outros insetos ou leveduras. RESULTADOS: O sistema de ensaio livre de células usando sGMRα rendeu os dados com alta plasticidade e confiabilidade. GM-CSF ligação a sGMRα foi dose-dependente inibida por policlonal GM-CSF auto-anticorpos de forma semelhante ao bioensaio usando TF-1 células, indicando que o nosso novo livre de células do sistema de ensaio utilizando sGMRα é mais útil para a medição da atividade neutralizante de GM-CSF auto-anticorpos que o sistema de bioensaio utilizando TF-1 célula ou células humanas de medula óssea. CONCLUSÕES: Nós estabelecemos um ensaio livre de células quantificar a capacidade de neutralização da GM-CSF auto-anticorpos.

Nós projetamos um ensaio de receptor de células livres vinculativas, a fim de estimar a ligação de granulócitos e macrófagos fator estimulante de colônia (GM-CSF) para os receptores. Ele nos permite avaliar inibição competitiva do biotinilado GM-CSF ligação a solúvel GM-CSF receptor alfa por GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade.

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FUNDAMENTOS: Anteriormente, demonstramos que a capacidade de neutralização, e não a concentração do autoanticorpo contra o GM-CSF, estava correlacionada com a doença...

O objetivo geral deste experimento é estabelecer um ensaio livre de células que quantifique a capacidade neutralizante do autoanticorpo anti-G-M-C-S-F. Começamos obtendo bichos-da-seda transgênicos. Introduzimos o gene humano SGMR alfa para produzir o SGMR alfa recombinante e, em seguida, procedemos à marcação do G-M-C-S-F humano recombinante por meio de bioTE.A seguir, avaliamos a correlação entre o sistema livre de células e um bioensaio convencional por meio de um estudo da inibição da ligação de G-M-C-S-F ao receptor alfa de SGMR por autoanticorpos contra G-M-C-S-F. Os resultados obtidos demonstram uma correlação significativa entre a inibição do crescimento no bioensaio e a inibição da ligação no sistema livre de células pelas frações de IgG sérica e pelos autoanticorpos purificados contra G-M-C-S-F. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o bioensaio TF, é que este sistema permite uma alta análise com boa reprodutibilidade para medir a capacidade neutralizante de autoanticorpos contra GM CSF.Como o autoanticorpo contra GM-CSF causa prognóstico primário autoimune geral, as implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico. Também pode ser ap

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a diferenciação in vitro do fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos ou células T auxiliares produtoras de GM-CSF (THGM). As células T virgens isoladas são estimuladas para diferenciação em THGM, o que é confirmado pela detecção de alta produção intracelular de GM-CSF e uma baixa expressão de outras citocinas específicas de células T auxiliares.

Uma técnica in vitro para diferenciar células T auxiliares produtoras de GM-CSF de células T virgens

Este vídeo demonstra ensaios de microneutralização para medir anticorpos neutralizantes usando células renais caninas Madin-Darby que superexpressam ácido siálico ligado a α2,6 em soros humanos. Este ensaio é frequentemente usado para sorologia humana para...

Um ensaio de microneutralização para medir títulos de anticorpos neutralizantes em soro humano

Ao longo dos últimos anos, os ensaios baseados em células vivas têm sido utilizados com sucesso para detectar anticorpos contra antigénios de superfície e de conformação. Aqui, descrevemos um método que utiliza o fluxo de alto rendimento citometria permitindo a análise de grandes grupos de pacientes. Detecção de novos anticorpos irá melhorar o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados pela imunes.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Nós descrevemos um método para medir a ativação das funções efetoras Fc-mediada por anticorpos que visam a hemaglutinina do vírus da gripe. Este ensaio também pode ser adaptado para avaliar a capacidade dos anticorpos monoclonais ou policlonais soros visando outras glicoproteínas de superfície virais para induzir imunidade mediada por Fc.

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

Ectopically manifestámos NR1 subunidade do receptor NMDA marcado com proteína verde fluorescente em células embrionárias humanas (HEK293) como antígeno para detectar anticorpos contra o receptor NMDA no sangue de pacientes suspeitado com encefalite auto-imune. Este método simples pode ser adequado para fins em situações clínicas de triagem.

Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue

Aqui nós apresentamos um método de citometria de fluxo baseados em células para detectar anticorpos neutralizantes ou outros fatores que interferem com a absorção celular de terapias de substituição enzimática em uma matriz humana, tais como fluido espinal cerebral (CSF) ou soro humano.

Anticorpos que neutralizam a absorção celular de terapias de substituição enzimática com um ensaio de baseada em célula de

Aqui, apresentamos um protocolo para diferenciar murino células auxiliares (THGM) T granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing de células T CD4 + de ingênuo, incluindo o isolamento de células T CD4 + de ingênuo, diferenciação de THGM, e análise de células THGM diferenciadas. Esse método pode ser aplicado aos estudos do regulamento e função das células THGM.

In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (THGM)

Este estudo descreve um método para isolar vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fatores estimulantes da colônia de granulocitos imunes de células-tronco embrionárias.

Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias

Apresentamos um método geneticamente livre de modificações (livre de GM) para obter células com um fenótipo neuronal de células sanguíneas periféricas reprogramadas. A ativação de uma via de sinalização ligada à nova proteína ligada ao GPI humano revela um método eficiente livre de GM para a obtenção de células-tronco pluripotentes humanas.

Geração livre de células neuronais derivadas do sangue

O uso de reagentes de referência para ensaio de liberação de citocinas permite perfis de segurança in vitro mais reprodutíveis e padronizados de anticorpos monoclonais imunoterapêuticos. Aqui, descrevemos como os ensaios de liberação de citocinas podem ser usados juntamente com um painel de reagentes de referência para prever a segurança de alguns anticorpos monoclonais terapêuticos.

Usando reagentes de referência para confirmar a robustez dos ensaios de liberação de citocinas para a previsão da segurança do anticorpo monoclonal

Descrevemos uma plataforma de imunoensaio recentemente desenvolvida com base nos princípios da biologia sintética livre de células e na técnica de dot-blot para detecção personalizável da resposta de anticorpos em soros humanos e animais.

Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais

Aprenda a quantificar a capacidade de neutralização de autoanticorpos GM-CSF usando um ensaio de ligação livre de células com SGMR alfa recombinante. Este método oferece alta reprodutibilidade para pesquisa imunológica.

A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel (Vídeo) | JoVE Journal

A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel

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