A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel

O objetivo geral deste experimento é estabelecer um ensaio livre de células que quantifique a capacidade neutralizante do autoanticorpo anti-G-M-C-S-F. Começamos obtendo bichos-da-seda transgênicos. Introduzimos o gene humano SGMR alfa para produzir o SGMR alfa recombinante e, em seguida, procedemos à marcação do G-M-C-S-F humano recombinante por meio de bioTE.

A seguir, avaliamos a correlação entre o sistema livre de células e um bioensaio convencional por meio de um estudo da inibição da ligação de G-M-C-S-F ao receptor alfa de SGMR por autoanticorpos contra G-M-C-S-F. Os resultados obtidos demonstram uma correlação significativa entre a inibição do crescimento no bioensaio e a inibição da ligação no sistema livre de células pelas frações de IgG sérica e pelos autoanticorpos purificados contra G-M-C-S-F. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o bioensaio TF, é que este sistema permite uma alta análise com boa reprodutibilidade para medir a capacidade neutralizante de autoanticorpos contra GM CSF.

Como o autoanticorpo contra GM-CSF causa prognóstico primário autoimune geral, as implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico. Também pode ser aplicada em ensaios competitivos de ligação ao tib utilizando receptores citocinéticos recombinantes, tais como receptores para BEGF e TNFA. A demonstração do procedimento será apresentada por um aluno de doutorado do meu laboratório. Ele desenvolveu inicialmente este sistema livre de pH.

Este vídeo mostra o bicho-da-seda utilizado para a produção da SGMR alfa recombinante. O primeiro passo é amplificar o cDNA para a SGMR alfa a partir de uma biblioteca de cDNA de placenta humana por reação em cadeia da polimerase com o amplicon PCR resultante. Realize uma segunda PCR para adicionar uma sequência de 50 bases do extremo 5' da região não traduzida (UTR) do poliadenilato do vírus ULA ao extremo 5'.

E para marcar um R RRGs, marque-o na extremidade três prima, clone o produto R amplificado por PCR no plasmídeo P MSG um um mg, coinjete o construto PS GMR/ M1 um mg com o vetor auxiliar PHA três pig em ovos da linhagem de bicho-da-seda PNDW um. Crie as larvas eclodidas G zero até se tornarem mariposas a 25 graus Celsius. Em seguida, selecione embriões G um, acasalando indivíduos irmãos entre si ou com PNDW um, com base na expressão de MG FP nos olhos, indicativa de bichos-da-seda transgênicos portadores.

O gene SGMR alfa prossegue com a extração do SGMR alfa recombinante dos casulos de bichos-da-seda transgênicos com tampão fosfato contendo cloreto de sódio 500 milimolar e agita a quatro graus Celsius por 24 horas. Centrifugue as amostras a 20.000 ×g por 15 minutos. Para remover os precipitados, aplique o fluido sobrenadante em uma coluna de afinidade com níquel.

Lave a coluna e dilua as proteínas com um gradiente linear de ole de 10 milimolares a 250 milimolares. Reúna as frações contendo o SGMR alfa purificado e diализar contra salina tamponada com fosfato. Primeiro, diализar as amostras com PBS.

Para remover o sorbitol da preparação G-M-C-S-F, adicione um mililitro de solução fria de meta-dato de sódio 20 milimolar e incube a amostra por 30 minutos em gelo, no escuro. Em seguida, adicione glicerol até uma concentração final de 15 milimolar e realize diálise contra tampão de acetato de sódio 100 milimolar. Para prosseguir, adicione azida de biotina à solução numa concentração final de cinco milimolar e misture por duas horas à temperatura ambiente.

Por fim, remova o material não reativo por diálise contra PBS, recubra uma placa de microtitulação com 50 microlitros de anticorpo monoclonal anti-poli-histidina durante a noite a quatro graus Celsius. Lave cinco vezes com PBST. Em seguida, adicione 100 microlitros de uma solução bloqueadora e incube por três horas a quatro graus Celsius.

Novamente, lave cinco vezes com PBST. Adicione 50 microlitros de SGMR alfa na solução bloqueadora e incube durante a noite a quatro graus Celsius após cinco lavagens com PBST. Adicione 25 microlitros das amostras contendo autoanticorpo G-M-C-S-F e, em seguida, 25 microlitros de G-M-C-S-F biotinilado, e incube por uma hora a quatro graus Celsius.

Para formar o complexo SGMR alfa G-M-C-S-F. Continuar lavando cinco vezes com PBST e, em seguida, adicionar 50 microlitros de estreptavidina fosfatase alcalina por uma hora a quatro graus Celsius para detectar o G-M-C-S-F biotinilado ligado ao SGMR alfa. Lavar cinco vezes com PBST e adicionar 50 microlitros de um substrato de quimioluminescência à solução, incubando por uma hora à temperatura ambiente e determinar a atividade de quimioluminescência utilizando um leitor de placas. Na análise por SDS-PAGE, o SGMR alfa recombinante derivado do bicho-da-seda está presente nas formas monomérica e DME em condições não redutoras, mas apenas na forma monomérica em condições redutoras.

Essa mistura recombinante de monômeros e dímeros ligados por dissulfeto de SGMR alfa é funcional em um ensaio de ligação competitiva. O complexo de G-M-C-S-F biotinilado com SGMR alfa exibe especificidade, pois pode ser dissociado pela adição de várias concentrações de anticorpo neutralizante, mas não por anticorpo não neutralizante. Além disso, concentrações crescentes de anticorpos neutralizantes contra G-M-C-S-F correlacionam-se positivamente com aumento percentual da inibição da ligação de forma dependente da dose.

Conforme esperado, a inibição da ligação dos anticorpos não neutralizantes de G-M-C-S-F não foi dependente da dose. Este sistema livre de células demonstra uma forte correlação entre a inibição da ligação de G-M-C-S-F ao alfa SGMR por autoanticorpos anti-G-M-C-S-F, com valores calculados de r igual a 0,988 e valor de P de 0,002. A inibição da ligação aumentou de maneira dependente da dose pelos autoanticorpos anti-G-M-C-S-F.

Da mesma forma, a inibição da ligação correlacionou-se significativamente com a inibição do crescimento da importação. Este ensaio possui utilidade e análise das frações de IgG sérica de pacientes com PAP autoimune, conforme demonstrado aqui pela relação entre a IC50 para porcentagem de inibição da ligação e a porcentagem de inibição do crescimento pelas frações de IgG sérica. Além disso, o coeficiente de variação entre experimentos indica uma vantagem do sistema livre de células em comparação com o bioensaio de inibição do crescimento.

Uma vez dominada, esta análise de ligação do ligante ao receptor GM GSF livre de células pode ser concluída com sucesso em 38 horas. É importante lembrar de manter a reação, a temperatura e o tempo de incubação. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de triagem das atividades biológicas de medicamentos com anticorpos nobres, substituindo os bioensaios convencionais.