Name: Visualização das células intersticiais de Cajal Network (ICC) em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a visualizar redes de células intersticiais de Cajal no trato gastrointestinal de camundongos usando imunofluorescência. Este método permite analisar a arquitetura celular em preparações de montagem total e cortes transversais.

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Este trabalho foi financiado pelo National Cancer Institute (K08CA140946, para YC), (5F32CA130372, para PC), (R01CA102774 e R01HL055748 a PB), o Departamento de Defesa (PC094302 para YC), o Fundo de Pesquisa da Família Shuman GIST (para PC), eo Consórcio Cancer Starr (para PC, YC, CLS e PB). Gostaríamos de agradecer a Katia Manova, Fan Ning, e Mesurh Turkekul da instalação do núcleo Molecular Citologia MSKCC para ajudar com cryosectioning e imunomarcação.

1. Dissecção do mouse trato GI <ol><li> Camundongos submetidos à eutanásia por locais diretrizes IUCAC </li><li> Pin cada membro na superfície de isopor e enxaguar superfície abdominal com etanol 70%. Abra cavidade abdominal com incisão mediana longo do diafragma para púbis. Fazer um corte no esôfago distal e um segundo corte no intestino distal grande e remover o trato GI do estômago ao ânus em bloco, corte cuidadosamente ligamentos no duodeno e ceco com uma tesoura pequena. Trato GI lugar numa placa de Petri com PBS. Dissecar longe mesentério usando uma pinça (Figura 1). Para separar o estômago, intestino delgado e intestino grosso, cortado em piloro e junção ileocecal. Lavar o lúmen de cada parte do trato GI com PBS usando uma seringa de 5ml preso a uma agulha de alimentação (ratos mais velhos) ou agulha sem corte (ratos mais jovens). </li><li> Estômago aberto, intestino delgado, intestino grosso e ao longo da borda mesentérica. Corte dois pedaços para cada parte do trato gastrointestinal, um para visualização montar todo e um para cryosection. </li></ol> 2. Preparação da amostra toda montagem e imunomarcação <ol><li> Coloque a peça inteira de cada parte do trato gastrointestinal em um tubo de microcentrífuga 1,5 centímetros cheia com 1,0 ml de acetona gelada e amostras de correção para pelo menos 1 hora a 4 ° C. Amostras podem ser armazenadas por até uma semana a -20 ° C. Nós normalmente armazenam amostras em acetona e prossiga para preparar cyrosections. </li><li> Lave 2X amostra com PBS. Colocar a amostra em placa de Petri com PBS. Sob dissecar miscroscope, cuidadosamente raspar camada mucosa com um bisturi, segurando uma ponta com um par de pinças, deixando a muscularis. </li><li> Muscular pode ser cortado em pedaços de 5 mm para coloração com anticorpos diferentes. Não armazenar por mais de dois dias em PBS antes da coloração. </li><li> Passos de bloco e de incubação pode ser feito em um poço de uma placa de 24 poços ou em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Bloco com 0,5 ml de tampão de bloqueio (soro de cabra 5%, 0,1% Triton X-100 em PBS por 1 hora a 4 ° C). </li><li> Incubar com anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e rodar durante a noite a 4 ° C. Temos utilizado com sucesso ACK-2 rato anti-Kit, coelho anti-Ano1, e de coelho anti-Pgp9.5 anticorpos para a imunocoloração montar todo. </li><li> Lavar por 5 min 2X com PBS em rotator em temperatura ambiente. </li><li> Incubar com anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas a temperatura ambiente em rotador. Normalmente usamos Alexa Fluor 488 anti-coelho e Alexa Fluor 594 anti-rato anticorpos. </li><li> Lavar por 15 min 3X com PBS em rotator em temperatura ambiente. </li><li> Montagem no slide, lado seroso em cima para garantir a orientação do tecido durante a microscopia. Esta orientação irá garantir o lado seroso para enfrentar a lamela e ser encontrado primeiro como uma foca no slide em um microscópio. Fazemos isso em um microscópio de dissecação. Às vezes, examinaremos brevemente o tecido sob microscopia de fluorescência para orientar corretamente. Sob microscopia de fluorescência para visualizar Kit ou Ano1, deve-se encontrar o ICC-MY primeira rede do lado da lamela. Em seguida, aspirar PBS, tanto quanto possível, sem secar completamente. Adicionar 50 ul de media set difícil de montagem (usamos Prolong Gold) e coloque delicadamente lamínula em cima do tecido. Permitir configuração de montagem durante a noite a temperatura ambiente e slides armazenar a -80 ° C. </li><li> Para exame microscópico, foi utilizado um microscópio de campo amplo com um Z-drive. Usamos tanto o objectivo de ar 20X (NA 0,75, Apochromat plano) ou objetivo do petróleo 60X (NA 1.4, Apochromat plano) e tomou 2 m ou 1 mícron Z-seções que abrangem a muscularis inteiro. As imagens foram posteriormente deconvoluídos usando software deconvolução Autoquant. Alternativamente, muitos outros usaram microscopia confocal vez com resultados semelhantes. </li></ol> 3. Preparação Cryosection e imunomarcação <ol><li> Coloque cada parte do trato GI, lado seroso baixo, flat em papel de filtro. Corte de papel de filtro em todo o tecido. Coloque o tecido em papel de filtro em paraformaldeído 4% (PFA) em PBS (nós diluir paraformaldeído 32% em frasco lacrado em PBS direito antes do uso) por 2 horas em temperatura ambiente. Fixação pode ser feito em um 6 - ou 12 bem-placa, dependendo do tamanho do tecido, ou em um microtubo de 1,5 ml. Se feito em chapa, parafilme para minimizar a exposição PFA. Vezes mais tempo de fixação pode resultar em mascaramento de antígenos, particularmente para o ACK-2 anticorpo anti-Kit. </li><li> Remover o tecido da PFA e coloque em sacarose 30% em PBS. Permitir que o tecido a afundar durante a noite em 4 ° C. </li><li> Equilibrar tecido com relação 1:1 de sacarose 30% e outubro por 1 hora. Então monte de tecidos verticalmente em cryomold cheia de outubro O eixo longitudinal do trato GI deve ser em paralelo com o cyrosections. Ao examinar os ratos com diferentes genótipos ou com diferentes tratamentos, pode ser útil para a montagem de tecido de ratos em diferentes cryomold mesmo para assegurar o processamento paralelo. Congelamento de gelo seco e colocar em freezer -80 ° C para armazenamento. </li><li> Corte de 10 mM criosecçõesem slide e armazenar a -80 ° C freezer. Nós normalmente cortadas por duas seções de slides. Também costumam fazer H &amp; E de coloração de uma lâmina cryosection. </li><li> Para imunofluorescência, primeiro deslize equilibrar à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, desenhar círculo em torno do tecido usando caneta PAP. </li><li> Bloco com 150 mL de tampão de bloqueio (o mesmo que para a imunocoloração montar todo) por 1 hora. </li><li> Aspirar tampão de bloqueio e adicionar 150 mL de anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C em câmara úmida. </li><li> Lavar 5 min 2x com PBS. </li><li> Incubar com anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente. Normalmente usamos Alexa 488 anti-coelho e Alexa 594 anti-rato anticorpos. </li><li> Lavar por 15 min 3X com PBS. </li><li> Aspirar slide sem secagem total do tecido. Adicionar uma gota de set difícil de montagem de mídia com DAPI (usamos Prolong Gold) e coloque # 1.5 lamela. Slides lugar à temperatura ambiente durante a noite para definir e armazenar em freezer -80 C °. </li><li> Adquirir triple imagens de fluorescência usando DAPI, FITC, e define Texas Red filtro. </li></ol> 4. Resultados representativos: Aqui, usamos o intestino grosso como um exemplo. H &amp; E mancha de sacarose protegida fixa de congelação utilizado para imunofluorescência mostra alguns artefatos em comparação com uma seção de parafina de referência (Figura 2), onde a linha amarela demarks do plexo mioentérico entre as camadas musculares circular e longitudinal ea demarks linha verde na fronteira entre o mucosa e muscularlis. Examinando o cryosection, a partir da serosa a mucosa, você primeiro encontro da mais fina camada muscular longitudinal (LM), seguido do circular camada mais espessa do músculo (CM). A seção deve ser em paralelo com o músculo longitudinal para os núcleos de LM deve ser um pouco alongados, enquanto os núcleos do CM deve ser pequeno e redondo. Entre o LM e CM são plexi mioentéricos feito de neurônios que mancha com Pgp9.5. Pgp9.5 também processa manchas neuronal durante todo o CM. A rede mioentéricos ICC (ICC-MY) cercam o plexo mientérico e são feitos de células multipolar. Dentro da camada muscular longitudinal, há ICCs rara intramuscular (ICC-IMs), que são células bipolares operando em paralelo com o músculo. Dentro da camada muscular circular, existem abundantes ICC-IMs que também são células bipolares que correm paralelas com o músculo circular e são seccionadas transversalmente com este corte. Na junção dos muscularis e submucosa, a rede composta por submucosa ICC ICC-SMPs é uma rede fixa de ICCs multipolar. Examinando o Kit montar toda imunocoloração do intestino grosso, deve-se esperar encontrar o ICC-MY primeira rede, e então o ICC-IM do CM, e ICC-SMP redes, como uma foca da lamela (Figura. 3) . Medida volumétrica de redes ICC usando reconstrução 3D de toda montagem de imagens têm sido descritas 10. Usando wide-campo do microscópio, há fluorescência fora do plano significativa nas imagens-primas que podem ser removidos após a deconvolução (Figura 3). Incompleta stripping de mucosa irá resultar em alta fluorescência de fundo. ANO1 é outro marcador da ICC e co imunocoloração de KIT e ANO1 mostra sobreposição completa de ICC coloração (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Representante figura 1. Dissecados do trato gastrointestinal do rato, reimpresso com permissão 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A) Representante H &amp; E coloração do intestino do rato grande de criosecções preparado como descrito e parafina referência incorporados secção que mostra alguns artefatos encolhimento de criosecções. O demarks linha amarela do plexo mioentérico ea linha azul separa a mucosa da muscularis. B) Representante Kit (vermelho, ACK-2) e Pgp9.5 (verde) imunofluorescência dupla com DAPI contracoloração (azul) do intestino de rato grande. LM: CM muscular longitudinal: músculo circular. Barra de escala 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante Kit (vermelho, ACK-2) imunofluorescência toda montagem do mesmo campo em três planos focais, o ICC-MY avião na fronteira LM / CM, o avião ICC-IM na CM, e-ICC SMP avião na fronteira CM / submucosa. Imagens brutas e imagens deconvoluídos são mostrados. Barra de escala 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Representante dupla imunofluorescência de Ano1 (verde) e Kit (vermelho, ACK-2) no intestino grosso. Barra de escala 20 mM.

<ol><li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li>
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<li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li>
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<li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Células intersticiais de Cajal foram inicialmente caracterizados por Santiago Ramóón y Cajal exatamente um século atrás com manchas de azul de metileno e prata cromato de muscularis gastrointestinal. Cajal inicialmente pensado ICC foram neurônios com base em seus processos que são uma reminiscência de axônios e dendritos. Ao longo de muitos anos que se seguiram, o estudo da biologia ICC tem sido limitada pela falta de marcadores específicos, até a descoberta de que o KIT não só se expressa no ICC, mas também é necessário para o seu desenvolvimento 6. Desde então, KIT imunofluorescência tem sido amplamente utilizada no estudo da biologia e ICC também levou à valorização do ICC em outros órgãos contráteis, como a bexiga urinária. Recentemente, ANO1 tem sido identificada como um marcador ICC segundo confiável. Houve inúmeras publicações nos últimos 15 anos através de imunofluorescência para identificar ICC usando vários fixação e técnicas de montagem. Em nossas mãos &quot;fixed-congelados&quot; criosecções que foram prefixados com paraformaldeído e sacarose protegidos funciona melhor em comparação com acetona ou paraformaldeído pós-fixação após cryosectioning. Para montagens todo, descobrimos que a fixação acetona seguido de dissecção da mucosa dá os resultados mais robustos. Historicamente, o ACK-2 foi o anticorpo Kit de escolha para mouse ICC identificação. É um rato monoclonal que reconhece o domínio extracelular e é também um anticorpo de bloqueio que faz com íleo quando administrado a ratos vivem. No entanto, o epítopo ACK-2 é lentamente destruída pela fixação paraformaldeído e não é resgatado por métodos de recuperação padrão antígeno. Descobrimos que o epítopo ACK-4 é mais resistente à fixação paraformaldeído. Em comparação com fixo blocos congelados e seções, blocos parafinados e seções preserva a morfologia melhor e é mais fácil de longo prazo de arquivamento (Figura 4). Nem ACK-2 nem ACK-4 tem sido utilizado com sucesso em seções de parafina. Temos que caracteriza D13A2, um anticorpo monoclonal de coelho nova, funciona muito bem em ambas as seções fixas congelado e parafina do trato gastrointestinal. Kit é expressa em vários outros tipos de células, incluindo os melanócitos, células hematopoiéticas, células germinativas, e em particular que os mastócitos também são encontrados no trato gastrointestinal. Felizmente, a maioria das células são encontradas mastro é a mucosa e não na muscularis. Coloração dupla com coelho anti-rato Ano1 e anti-Kit pode eliminar coloração não específica de cada anticorpo (Figura 4). É importante notar também que a expressão relativa do Kit e Ano1 entre subclasses de ICC parece diferente. Por exemplo, no intestino delgado, coloração Kit é muito mais intensa no ICC mioentéricos em comparação com ICC das profundezas do plexo muscular enquanto Ano1 coloração é comparável.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> anticorpo anti rato Kit (clone ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> Use a 2μg/ml. Epitopo é perdido com overfixation. </td></tr><tr><td> anticorpo anti rato Kit (clone ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> Use a 2μg/ml. </td></tr><tr><td> coelho de anticorpos anti-KIT (clone D13A2) </td><td> Sinalização celular </td><td> 3074 </td><td> Use a diluição 1:100. Único anticorpo listados aqui que funciona bem em seções de parafina. </td></tr><tr><td> coelho de anticorpos anti-Pgp9.5 </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Etiquetas citoplasma da célula neuronal. Útil para marcar os neurônios do plexo mioentérico. Use a 1:1000 diluição. </td></tr><tr><td> coelho de anticorpos anti-Ano1 </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> Use a 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 cabra anti-IgG de rato </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> Use a 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> Use a 2μg/ml </td></tr><tr><td> Agulha Alimentação Animal </td><td> Pescador </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon ponta de agulha útil para a lavagem do trato GI de ratos adultos </td></tr><tr><td> Agulha Blunt </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Agulha Blunt útil para a lavagem do trato GI de pré-desmamados filhotes </td></tr><tr><td> Prolongar reagente Antifade ouro com DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Pode usar alternativas hard-configuração de mídia de montagem com DAPI </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek outubro </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído 32% (10ml ampola selada) </td><td> EM Sciences </td><td> 15714 </td><td> Ampola selada aberta e diluída a 4% imediatamente antes da utilização </td></tr><tr><td> Tampão de bloqueio </td><td></td><td></td><td> Soro de cabra 5%, 0,1% Triton X-100 em PBS </td></tr></tbody></table>

visualização das células intersticiais de cajal network (icc) em ratos

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

As células intersticiais de Cajal (ICC) são mesenquimais derivadas &quot;células marca-passo&quot; do trato gastrointestinal (TGI) que geram ondas lentas espontânea necessários para o peristaltismo e mediar entrada neuronal do sistema1 nervoso entérico. Diferentes subtipos de ICC formar redes distintas na muscularis do trato gastrointestinal 2,3. Perdas ou danos a essas redes está associada a uma série de distúrbios de motilidade 4. Células ICC expressar a tirosina quinase do receptor KIT sobre a membrana plasmática e KIT imunocoloração tem sido usado nos últimos 15 anos a label da rede ICC 5,6. Importante, a atividade KIT normal é necessário para o desenvolvimento ICC 5,6. Transformação neoplásica de resultados ICC células no tumor estromal gastrointestinal (GIST), que freqüentemente porto mutações de ganho de função-KIT 7,8. Recentemente, mostrou que ETV1 é um fator de sobrevivência de linhagem específica expressa na linhagem ICC / GIST e é um regulador mestre de transcrição necessários para tanto a formação de rede normal ICC e para de tumorigênese GIST 9. Nós ainda demonstrar que coopera com mutações ativadoras KIT na tumorigênese. Aqui, descrevemos os métodos de visualização de redes de ICC em ratos, em grande parte com base em protocolos previamente publicados 10,11. Mais recentemente, o canal de cloro anoctamin 1 (ANO1) também tem sido caracterizada como um marcador específico de membranas de ICC 11,12. Devido a sua localização membrana plasmática, imunofluorescência de ambas as proteínas podem ser usadas para visualizar as redes ICC. Aqui, descrevemos a visualização das redes fixas por ICC congelado cyrosections e preparações montar todo.

As células intersticiais de Cajal (ICC) são as células marcapasso do trato gastrointestinal (TGI). Eles formam redes complexas entre as células do músculo liso e fibras pós-ganglionares neuronal para regular a contratilidade GI. Aqui, apresentamos métodos de imunofluorescência transversal e todo o monte de visualização de redes murino ICC.

Visualização das células intersticiais de Cajal Network (ICC) em ratos

As células intersticiais de Cajal (ICC) são "células marcapasso" de origem mesenquimal do trato gastrointestinal (GI) que geram ondas lentas espontâneas...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar as redes de Células Intersticiais de Cajal (ICC) do trato gastrointestinal (GI) de camundongo. Isso é realizado primeiramente pela dissecação e isolamento de todo o trato GI, separando-o em estômago, intestino delgado, ceco e intestino grosso. Em seguida, cada parte do trato GI é fixada, seja em acetona seguida de remoção da mucosa para imagem em montagem inteira, seja em formaldeído a 4%, seguida de inclusão e crio-seccionamento para imagem em corte transversal.As amostras são então imunomarcadas contra o kit e outros epítopos para identificar as CCI e outras estruturas relevantes. Por fim, são obtidas imagens utilizando um microscópio de fluorescência. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram os efeitos de manipulações genéticas ou ambientais em camundongos sobre a arquitetura das CCI por meio da microscopia de imunofluorescência.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de ICC, como a forma pela qual redes de sinalização específicas e fatores de transcrição afetam as arquiteturas da rede de ICC. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois a remoção inadequada da camada mucosa e a orientação incorreta do preparo em lâmina inteira resultarão em coloração de fundo significativa e perda do sinal específico. Para iniciar a dissecação do trato gastrointestinal de camundongo, fixe as patas de um camundongo eutanasiado sobre uma superfície de isopor e lave a superfície abdominal com etanol a 70%. Abra a cavidade abdominal com uma incisão mediana longa, indo do diafragma até a sínfise púbica.Realize um corte no esôfago distal e um segundo corte no intestino grosso distal, e remova todo o trato gastrointestinal, do estômago até o ânus, em bloco. Corte cuidadosamente os ligamentos no duodeno e no íleo usando uma tesoura pequena. Coloque o trato gastrointestinal em uma placa de Petri com PBS.Disseque o mesentério usando pinças para separar o estômago, o intestino delgado e o intestino grosso. Corte nas junções pilórica e íleo-cecal utilizando uma seringa de cinco mililitros acoplada a uma agulha de alimentação ou agulha romba. Lave a luz de cada parte do trato gastrointestinal com PBS.Abra o estômago, o intestino delgado e o intestino grosso ao longo da borda mesentérica. Corte duas amostras de cada órgão gastrointestinal, uma para visualização em preparação inteira (whole mount) e outra para cortes criostáticos. Fixe a amostra em preparação inteira em acetona antes da crioseção para preparar a amostra para imunomarcação.Primeiro, lave a amostra duas vezes em PBS. Em seguida, coloque a amostra em uma placa de Petri com PBS sob um microscópio estereoscópico. Remova cuidadosamente a camada mucosa com um bisturi, segurando uma das extremidades com pinça, deixando o músculo; corte o músculo em pedaços de cinco milímetros para coloração com diferentes anticorpos.Não armazene a amostra por mais de dois dias antes da coloração em um tubo microfugir de 1,5 mililitro. Incube a amostra no tampão bloqueador durante uma hora a quatro graus Celsius. Em seguida, incube a amostra nos anticorpos primários diluídos no tampão bloqueador, com rotação, durante a noite a quatro graus Celsius.Utilizamos com sucesso um anticorpo primário de camundongo anti-CK dois, um anticorpo secundário de coelho anti-rato, um anticorpo primário de coelho anti-a O um e um anticorpo de coelho anti-PGP 9.5 para coloração em montagem inteira. Na manhã seguinte, lave as amostras duas vezes, por cinco minutos cada, em PBS com rotação suave.Em seguida, incubar as amostras em anticorpos secundários diluídos em tampão bloqueador por duas horas. À temperatura ambiente, normalmente utilizamos anticorpos Alexa Fluor 4 88 anti coelho e Alexa 5 94 anti rato. Lavar as amostras em PB S três vezes, por 15 minutos cada.Usando um microscópio estereoscópico, monte as amostras em lâminas com o lado seroso voltado para cima, removendo o máximo possível de PBS. Aplique cerca de 50 microlitros de meio de montagem rígido e coloque uma lamínula por cima. Deixe o meio de montagem curar durante a noite e armazene as lâminas a menos 80 graus Celsius.Para visualização e aquisição de imagens, utilize um microscópio com objetiva de campo amplo. Com um controle Z, utilizamos uma objetiva de ar de 20 vezes ou uma objetiva de óleo de 60 vezes e adquirimos seções Z de um ou dois mícrons que abrangem toda a muscularis. As imagens são subsequentemente desconvolutas utilizando software de desconvolução automática.Alternativamente, a microscopia confocal pode ser utilizada para preparar cortes criogênicos para imunomarcação. Coloque cada parte do trato gastrointestinal com o lado sal voltado para baixo, sobre um papel-filtro. Corte o papel-filtro ao redor do tecido.Coloque o tecido sobre o papel filtro em paraformaldeído 4% em PBS por duas horas à temperatura ambiente. Tempos mais longos de fixação podem resultar em mascaramento do antígeno, particularmente para o anticorpo do kit a K dois anti. Transfira o tecido para sacarose 30% em PBS e deixe o tecido afundar durante a noite a quatro graus Celsius.Equilibre o tecido com uma proporção um para um de sacarose a 30% e OCT por uma hora. Em seguida, monte o tecido verticalmente em um molde para crioseção preenchido com OCT. O eixo longitudinal do trato gastrointestinal deve estar paralelo às crioseções.Ao examinar camundongos com diferentes genótipos ou provenientes de diferentes tratamentos, pode ser útil montar os tecidos de diferentes camundongos no mesmo molde para crioseção. Para garantir um processamento paralelo, congele os moldes em gelo seco e armazene a menos 80 graus Celsius. Corte secções criostáticas de 10 mícrons sobre lâminas, colocando duas secções por lâmina e armazene a menos 80 graus Celsius.Normalmente realizamos a coloração h e d em um lâmina para imunofluorescência. Primeiro, equilibre as lâminas à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, desenhe um círculo ao redor do tecido usando uma caneta pap.Incube os cortes em 150 microlitros de solução bloqueadora por uma hora. Aspire a solução bloqueadora e adicione 150 microlitros de anticorpo primário diluído em solução bloqueadora, incubando durante a noite a quatro graus Celsius em câmara umidificada. Após lavar com PBS duas vezes, por cinco minutos cada, incube as amostras com anticorpos secundários diluídos em solução bloqueadora por duas horas.À temperatura ambiente, geralmente utilizamos anticorpos Alexa 488 anti coelho e Alexa 594 anti rato. Lave as seções em PBS três vezes, por 15 minutos cada, e retire os lâminas sem deixar o tecido secar completamente. Adicione uma gota de meio de montagem rígido com DPI e coloque um lamínula número 1,5 por cima.Coloque as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para fixar as amostras usando conjuntos de filtros dpi, fite e Texas red. Examinando o intestino grosso do ceco até a mucosa. A camada mais fina de músculo longitudinal ou LM é encontrada primeiro, seguida pelo músculo circular mais espesso ou cm.A seção deve ser paralela ao músculo longitudinal e perpendicular ao músculo circular, de modo que os núcleos do ML devem ser um pouco alongados, enquanto os núcleos do MC devem ser pequenos e redondos. Entre o ML e o MC estão os plexos mioentéricos, compostos por neurônios que se coram com PGP 9.5, PGP 9.5. Também são visíveis processos neuronais corados por todo o MC ao examinar o preparo inteiro. Ao ajustar o foco a partir do coverslip, você encontrará a sequência I-C-C-M-Y-I-C-C-I-M do MC e I-C-C-S-M-P.A rede de CCI mioent&eacute;rica envolve o plexo mioent&eacute;rico e &eacute; composta por c&eacute;lulas multipolares dentro da camada de m&uacute;sculo longitudinal. Existem raras CCI intramusculares, que s&atilde;o c&eacute;lulas bipolares que correm paralelas ao m&uacute;sculo na camada de m&uacute;sculo circular. H&aacute; abundantes CCI ims, que tamb&eacute;m s&atilde;o c&eacute;lulas bipolares que correm paralelas ao m&uacute;sculo circular e s&atilde;o seccionadas transversalmente neste corte na jun&ccedil;&atilde;o da muscularis com a submucosa.A rede de CCI submucosa é uma rede plana de células multipolares. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, se for executada corretamente. Você deve ter um bom entendimento de como dissecar e imunomarcar o trato gastrointestinal de camundongo para observar a arquitetura dos CCI.

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