Name: Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprenda a detectar óxido nítrico e ânion superóxido em células usando espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica com armadilhas para spins. Este método permite identificar espécies reativas implicadas em doenças.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH National Heart, Lung, and Blood Institute concessão RO1 HL81248.

1. Cultura de Células endoteliais de aorta bovina (BAEC) <ol><li> Técnicas adequadas de assepsia foram seguidos. </li><li> Num meio de água do banho quente, sem antibióticos, a 37 ° C. </li></ol> Nota: O meio consiste em fenol meio Dulbecco modificado por Eagle livre (DMEM) com 4,5 g / L D-glucose, 4 mM de L-glutamina, 1% de não-aminoácidos essenciais, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 2,5 mg / L o factor de crescimento endotelial. <ol start="3"><li> Remover as células T75 balão contendo a partir da incubadora e limpar a superfície do balão com etanol 70% antes de colocá-lo dentro do capuz. </li><li> Remover o meio antigo usando um aspirador e lavar duas vezes com 5 ml de fosfato de Dulbecco tampão salina (DPBS). </li><li> Adicionar 2 ml de tripsina e esperar por 4-5 min para as células a separar enquanto periodicamente inspeccionar sob o microscópio. </li><li> Adicionar 3 ml do meio de misturar e repetidamente, utilizando uma pipeta de t separadoele células e criam uma suspensão mesmo. </li><li> Transferir 5 ml de meio com tripsina para um tubo de 15 ml e centrifugar a 121 g durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante utilizando um aspirador. Adicionar 5 ml de DPBS e misture bem. Centrifugar a 121g durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e re-suspender o sedimento de células por adição de 6 ml de meio. </li><li> Em uma placa de 6 poços, adicionar 1 ml da suspensão de células a cada poço, em seguida, adicionar 1 ml de meio. Misturar a suspensão utilizando uma pipeta. </li><li> Rotular o placa e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 2A. Detecção de NO com Cell BAEC <ol><li> Técnicas adequadas de assepsia foram seguidos. </li><li> Remova a placa de 6 poços da incubadora e aspirar o meio a partir do primeiro poço. Lave as células duas vezes com DPBS 1 ml. </li><li> Adicionar 210 uL de 1,9 mM de sulfato de ferro hepta-hidratado (II) (FeSO 4 .7 H2O, preparar recentemente por dissolução de 0,8 mg em1 ml com DPBS CaCl2 e MgCl2) e uL 210 de amónio de N-metil-D-glucamina ditiocarbamato (DGM, preparar recentemente por dissolução de 2,7 mg em 500 ul com DPBS CaCl2 e MgCl 2) utilizando um rácio de 1:7 . (Nota:. Este rácio onde MGD excesso é usado tem sido convencionalmente empregue para a preparação de Fe 2 +-MGD complexa devido ao facto de que o rendimento do Fe 3 +-MGD é maximizada na presença de excesso de MGD A adição de ascorbato em solução para estabilizar o Fe 2 +-MGD não é necessário uma vez que a NO-3 Fe +-MGD formado é endogenamente reduzido para o EPR ​​detectável NO-Fe 2 +-MGD por ascorbato, hidroquinona, ou cisteína com uma eficiência de conversão de até a 99,9% .. O estado diamagnético baixo spin de Fe 2 + permite a detecção de NO utilizando células plana ou tubo capilar, sem a necessidade de um dispositivo de baixa temperatura) 15. </li><li> Swirl a suspensão resultante bem e acrescente 4,6 μl de ionóforo de cálcio (CAI) (preparado a partir de uma solução stock de 1,9 mM por dissolução de 1 mg em 1 ml de DMSO). </li><li> Solução Agitar o novo e incubar a 37 ° C durante 36 min, a fim de permitir ainda mais redução de NO-Fe 3 +-MGD para o EPR ​​detectável NO-Fe 2 +-MGD. </li><li> Recolher o sobrenadante (425 ul) em um tubo de Eppendorf e transferência para uma célula de EPR plana (ou para um tubo de 50 uL capilar). </li><li> Parâmetros de aquisição EPR ​​são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3427 G; modulação de amplitude: 6,0 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 1 x 10 5; potência de microondas: 10 mW; número total de verificações: 121; tempo de varredura: 10 s; tempo e constante: 20 ms (Nota: Uma vez que os parâmetros variam de um instrumento e condições experimentais para outro, portanto, apenas o campo de centro, a freqüência ea modulação de amplitude são os parâmetros mais importantes a considerar.). </li><li> Gravar os espectros à temperatura ambiente e os espectros de 2-D foram integclassificado para reduzir o ruído de fundo ea linha de base corrigido usando Bruker WinEPR software de processamento de dados ou software de processamento de dados. Para a quantificação de formação de aduto, parcelas padrão de concentração versus intensidade de sinal (ou área) pode ser construída usando um SNAP dador NO. </li></ol> 2B. eNOS Experiment Desacoplamento <ol><li> Remova a placa de 6 poços da incubadora e aspirar o meio a partir do segundo poço e lavar duas vezes com DPBS 1 ml. </li><li> Um doador de peroxinitrito, 5-amino-3-(4-morfolinil) -1,2,3-oxadiazolium cloreto de (SIN-1) foi utilizado para desacoplar eNOS 16. Adicionar 100 uL de 0,5 mm de SIN-1 (M r 206,6 g / mol, a partir de 10 mM de solução stock preparada por dissolução de 1 mg de SIN-1 em 500 ul de PBS sem iões Ca / Mg) e diluído para 2 ml com DPBS e 10% de FBS. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Retirar a placa da incubadora e lavar duas vezes com DPBS. </li><li> Adicionar 210 uL de2,8 mM de FeSO 4 .7 H2O e 210 uL de 19,6 mM MGD recém-preparado de acordo com o procedimento acima mencionado. </li><li> Solução redemoinho e adicionar 4,6 ul de 1,9 mM CAI. </li><li> Solução Agitar o novo e incubar a 37 ° C durante 36 min. </li><li> Recolher o sobrenadante (425 ul) em um tubo de Eppendorf e transferência para uma célula de EPR plana. </li><li> Parâmetros de aquisição EPR ​​são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3427 G; modulação de amplitude: 6 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 1 x 10 5; potência de microondas: 10 mW; número total de verificações: 121; tempo de varrimento: 10 s; e constante de tempo: de 20 ms. </li><li> Gravar os espectros e os espectros de 2-D foram integradas para reduzir o ruído de fundo e de linha de base corrigido como mencionado acima. </li></ol> 3. Detecção de O 2 • - a partir de neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) <ol><li> Os neutrófilos foram isolados a partir de amostra de sangue humano, como descrito anteriormente 17. </li><li> Fazer uma solução stock de 1 M DMPO * em PBS contendo 0,1 mM de dietilenotriamina-pentacético ácido (DTPA). DMPO tem um ponto de fusão de 25-29 ° C por isso é mais conveniente para pipetar DMPO líquido (densidade ~ 1,02 g / ml a 25 ° C) para um frasco de vidro (Nota: não utilizar frascos de plástico para a pesagem de desde DMPO puro reage com plástico). Congelado DMPO pode ser derretido, executando água morna para o frasco (Nota: não correr água quente como DMPO pode se decompor). </li><li> É importante a utilização de elevada pureza DMPO (&gt; 99%) desde algumas das armadilhas de spin comercialmente disponíveis contêm impurezas paramagnéticas, e portanto, é imperativo para executar espectro EPR de apenas a solução DMPO por si só (10 mM, neste caso). É crítico que nenhum sinal de fundo é evidente (ver Figura 3A). </li><li> Preparar solução de reserva (1 mg / ml) de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) em DMSO. Fazer alíquotas por diluição da solução a 10 ug / ml em PBS. </li><li> Em um 1.5 ml tubo Eppendorf, preparar uma solução com um volume total de 0,6 ml, seguindo a sequência da adição: ~ 10 6 células por ml de PMN, D-glucose (1 mg / ml) e albumina (1 mg / ml), 10 mM DMPO e 0,2 ug / ml de PMA. (Nota: PMA é o activador de radicais e deve ser adicionado por último). </li><li> Transferir a solução para uma célula de EPR plana. </li><li> Parâmetros de EPR condições de aquisição são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3486 G; modulação de amplitude: 0,5 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 5 x 10 5; número total de exames: 10; tempo de varredura: 30 s ; potência de microondas: 20 mW; e constante de tempo: ms 81. Para a quantificação de formação de aduto, parcelas padrão de concentração versus intensidade de sinal (ou área) pode ser construída usando os nitróxidos estáveis, tais como TEMPO ou 3-carboxílico-PROXYL. </li></ol> * Nota importante sobre a utilização de DMPO: Ao utilizar uma célula plana, pode-se aumentar a densidade de células, e assim aumentar o sinalintensidade do aducto de rotação, mas a meia-vida de O 2 • - aducto de DMPO é curto (t 1/2 ~ 1 min), que se decompõe para DMPO-OH. DMPO podem ser substituídos usando as mesmas concentrações de Empo, BMPO ou DEPMPO que estão disponíveis comercialmente para a estabilidade aumentada aducto com t 1/2 ~ 8 e 14 min, respectivamente. 4. Os resultados representativos Girar aprisionamento de NO radical foi realizada utilizando Fe 2 +-MGD 2A. Figura e 2B mostram nenhum sinal EPR de Fe 2 +-MGD ou mistura de Fe 2 +-MGD com a CAI, indicando que nenhum sinal de fundo NO origina a partir destes reagentes. BAEC após estimulação com a CAI, que liberta NO reage com o Fe 2 +-MGD para formar o aducto de rotação, NO-Fe 2 +-MGD, e mostra um sinal tripleto característica com valor hiperfina separação (hfsc) constante de uma N = 12,66 G e fator g de g = 2,040. (Figura 2C). O hfvalor sc foi determinada utilizando o programa de simulação WINSIM que pode ser baixado do site NIEHS Banco de Dados Software EPR. O hfsc experimental é consistente com o valor da literatura de um N = 12,70 G e G = 2,041 18 para o NO Fe-2 +-MGD aduto. Do mesmo modo, o efeito de SIN-1 em BAEC baixou a produção de NO, devido à eNOS desacoplamento como mostrado na Figura 2D. DMPO armadilha de spin foi usado para O 2 • - detecção. DMPO por si só não deu um sinal conforme mostrado nas Figuras 3A e confirmação de que a armadilha de rotação é livre de impurezas paramagnéticas. A Figura 3B é o espectro de DMPO e PMNs apenas, e da mesma forma, não há sinal detectável, sugerindo que o DMPO não causar activação do NADPH oxidase enzima. A Figura 3C mostra o sinal observado EPR ​​após estimulação de PMN por PMA. Os valores hfsc para este sinal foram determinados como sendo um N = 14,71 G, um ebeta-H = 11,40 G e uma γ-H = 1,25 G, e são consistentes com os valores na literatura de um N = 14,3 G, uma β-H = 11,7 G e uma γ-H = 1,3 G 19 para DMPO-ó 2 aducto H. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 1"> Figura 1. Fluxograma para a detecção de radicais a partir de neutrófilos e BAEC utilizando armadilhas de spin de EPR. (A) PMNs foram misturados com DMPO e PMA, ea mistura resultante transferida para uma célula de EPR plana para aquisição de dados. (B) BAEC foram cultivadas numa placa, e lavou-se com DPBS. A rotação armadilha Fe (MGD) 2 foi adicionado juntamente com CAI. A solução foi misturada cuidadosamente e incubados. A mistura foi transferida para uma célula de EPR plana para a EPR aquisição de dados. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> Figura 2. Detecção EPR ​​de NO a partir de BAEC. (A) Espectro de Fe 2 +-MGD apenas (B) Espectro de Fe 2 +-MGD + CAI só. (C) Espectro de Triplet resultante a partir do NO aprisionamento por Fe 2 +-MGD usando CAI-estimulado células. (D) Espectro mostrando diminuição da produção de NO devido a 0,5 mM SIN-1 o tratamento de células. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 3"> Figura 3. Detecção EPR ​​de H 2 DMPO-O a partir de neutrófilos activados. (A) Espectro de 10 mM DMPO só. (B) Espectro de PMN sozinho na presença de 10 DMPO mM. (C) Espectro de PMN activado por PMA, na presença de 10 DMPO mM.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

EPR aprisionamento de rotação tem sido empregada em uma ampla variedade de aplicações biomédicas para quantificar e identificar os radicais livres. Aprisionamento de rotação é altamente sensível, capaz de detectar os radicais em concentrações que variam de nM a iM, tornando-o adequado para aplicação em sistemas biológicos. A formação do aduto paramagnético, NO-Fe 2 +-MGD, é a base de NO a detecção através de EPR. Fe 2 +-MGD reage com NO rapidamente 18 a uma taxa de ~ 10 6</...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Fenol meio DMEM livre Alta glicose 1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminoácidos não essenciais </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de crescimento endotelial </td><td> Millipore </td><td> 02-102 </td><td></td></tr><tr><td> CAI </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> A-23187 </td><td> Dissolve-se em DMSO </td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td> Dojindo Laboratories </td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td> FeSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 215.422-250G </td><td> Dissolve-se em PBS com Ca e Mg </td></tr><tr><td> MGD </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> ALX-400-014-M050 </td><td> Dissolve-se em PBS com Ca 2 + e Mg 2 + </td></tr><tr><td> Células BAEC </td><td> Cell Systems </td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS com CaCl2 e MgCl 2 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol miristato-acetato (PMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 79346-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de Óxido nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Azoto reactivo / espécies de oxigénio (ROS / RNS) a baixas concentrações desempenhar um papel importante na regulação da função celular, de sinalização, e da resposta imune, mas em concentrações não regulados são prejudiciais para a viabilidade da célula 1, 2. Embora os sistemas vivos evoluíram com mecanismos de defesa antioxidantes endógenos e dietético para regular ROS geração, ROS são produzidos continuamente como natural, através da sub-produtos do metabolismo normal de oxigénio e pode causar danos oxidativos a biomoléculas, resultando em perda da função da proteína, a clivagem de ADN, ou lípido peroxidação 3, e, finalmente, ao estresse oxidativo levando a lesão ou morte celular 4. Anião radical superóxido (O2 • -) é o principal precursor de algumas das espécies mais altamente oxidantes conhecidos de existir em sistemas biológicos, tais como o peroxinitrito e radical hidroxilo. A geração de O 2 • - sinaliza o primeiro sinal de explosão oxidativa e, portanto, idetecção st e / ou a apreensão em sistemas biológicos é importante. Nesta demonstração, O 2 • - foi gerada a partir de neutrófilos (PMN). Através da estimulação com quimiotáctica de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), PMN gera O 2 • - através da activação de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidase (NADPH) 5. O óxido nítrico sintase (NO) que vem em três isoformas, como induzível-,-neuronal e endoteliais-SOE, ou iNOS, nNOS ou eNOS, respectivamente, catalisa a conversão de L-arginina a L-citrulina, utilizando NADPH para produzir NO 6 . Aqui, nós gerado NO a partir de células endoteliais. Sob condições de stress oxidativo, eNOS por exemplo, pode mudar de produzir NO para O 2 • - por um processo chamado de desacoplamento, o que se acredita ser causada pela oxidação do heme 7 ou o co-factor, tetrahidrobiopterina (BH 4) 8. Há apenas poucosmétodos fiáveis ​​para a detecção de radicais livres em sistemas biológicos, mas estão limitados por especificidade e sensibilidade. Aprisionamento de rotação é vulgarmente utilizado para a identificação de radicais livres e envolve a reacção de adição de um radical de uma armadilha de spin formando um aducto de spin persistente que pode ser detectado por espectroscopia de ressonância paramagnética electrónica (EPR). Os aductos vários radicais apresentam espectro característico que pode ser usado para identificar os radicais sendo geradas e pode fornecer uma grande quantidade de informação sobre a natureza e da cinética da produção de radical 9. As nitronas cíclicas, 5,5-dimetil-pirrolina-N-óxido, DMPO 10, o DEPMPO fosforilo-substituído 11, eo éster-substituído, Empo 12 e BMPO 13, têm sido largamente utilizados como armadilhas de spin - o spin último armadilhas exibindo mais uma meia-vida de O 2 • - aduto. Ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe (DMG) 2 &lt;/&gt; Sub é vulgarmente usado para prender NO devido à elevada taxa de formação de aduto ea estabilidade elevada do adueto de rotação 14.

Electron paramagnético espectroscopia de ressonância (EPR) foi utilizado para detectar o óxido nítrico a partir de células endoteliais de aorta bovina e anião radical superóxido por neutrófilos humanos, utilizando ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe (DMG)<sub&gt; 2</sub&gt; E 5,5-dimetil-1-pyroroline-N-óxido, DMPO, respectivamente.

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Espécies reativas de nitrogênio/oxigênio (RNS/ROS) em baixas concentrações desempenham um papel importante na regulação da função celular, da sinalização e da resposta imunitária, mas em ...

Sou Frederick Dina, e sou professor associado de farmacologia aqui na Universidade Estadual de Ohio. Nesta demonstração, mostraremos a detecção de óxido nítrico e superóxido em células utilizando EPR com aprisionamento de spin.As espécies reativas de oxigênio e nitrogênio estão implicadas no desenvolvimento de diversas doenças, e por isso sua detecção em sistemas biológicos é de importância fundamental. Poucos métodos confiáveis para a detecção de espécies reativas têm sido empregados em sistemas biológicos, mas eles são limitados pela especificidade e sensibilidade. A técnica de spin trapping, no entanto, é comumente usada para a identificação de radicais livres e envolve a reação de adição de um radical a um agente capturador de spin nitroso ou a complexos metálicos, formando um aduto de spin persistente, que pode ser detectado por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica ou EPR; os diversos adutos de radicais exibem espectros distintivos que podem ser utilizados para identificar os radicais gerados e podem fornecer uma riqueza de informações sobre a natureza e a cinética da produção de radicais.A óxido nítrico sintase catalisa a conversão de L-arginina em L-citrulina utilizando NADPH para produzir óxido nítrico. Sob condições de estresse oxidativo, a eNOS pode alternar da produção de óxido nítrico para superóxido em um processo denominado desacoplamento, que acredita-se ser causado pela oxidação do grupo heme ou do cofator tetrahidrobiopterina. A regulação do óxido nítrico em sistemas biológicos é importante, pois desempenha um papel crítico na sinalização celular, resultando em funções fisiológicas benéficas, como vasodilatação, mas sua superprodução está frequentemente associada a condições inflamatórias. Portanto, a detecção de óxido nítrico em sistemas biológicos é importante.Outra classe importante de moléculas sinalizadoras em sistemas biológicos são as espécies reativas de oxigênio, como o óxido nítrico; em baixas concentrações, as espécies reativas de oxigênio desempenham um papel importante na regulação da função celular, sinalização e resposta imune, mas em concentrações não reguladas podem levar a danos oxidativos celulares, resultando em estresse oxidativo. O ânion radical superóxido é uma das espécies reativas de oxigênio mais importantes e é o principal precursor de algumas das espécies mais fortemente oxidantes conhecidas em sistemas biológicos, como o peróxido de nitrito e o radical hidroxila. A detecção e/ou sequestro do superóxido em sistemas biológicos é, portanto, importante, pois sua geração sinaliza o primeiro indício de explosão oxidativa antes do início.Este protocolo trypsiniza olhos de células endoteliais aórticas bovinas cultivadas conforme descrito no procedimento escrito. Transfira as células para uma placa de seis poços rotulada e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO2 após a incubação.Remova a placa de seis poços do incubador e aspire o meio do primeiro. Lave as células duas vezes com um mililitro de solução tampão salina fosfato de delcos ou DPBS. Prepare uma solução de sulfato de ferro heptaidratado 1,9 milimolar adicionando 0,8 miligramas de sulfato de ferro a um mililitro de DPBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.E prepare a solução de MGD adicionando 2,7 miligramas de MGD de amônio a 500 microlitros de DPBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio. Adicione 210 microlitros de sulfato ferroso heptaidratado recém-preparado a 1,9 milimolar e 210 microlitros de MGD recém-preparado usando uma proporção molar de um para sete e misture a suspensão resultante. Adicione 4,6 microlitros de íon cálcio quatro e misture novamente a solução pipetando para cima e para baixo.Em seguida, incubar a amostra a 37 graus Celsius por 36 minutos. Coletar o sobrenadante que se deposita em um tubo de einor. Inserir os parâmetros de aquisição de RPE com campo central de 34,27 gaus, amplitude de seis gaus e frequência de 9,8 gigahertz.Como os parâmetros variam de um instrumento e condição experimental para outro, consulte o texto para obter outros parâmetros utilizados neste equipamento. Transfira o sobrenatante para uma célula plana de RPE, feche com parafina e coloque na cavidade do espectrômetro de RPE. Registre os espectros por aproximadamente 21 minutos, com 121 varreduras e 10,4 segundos por varredura, após a execução do experimento.Utilize o processamento de EPR da Bruker WIN para corrigir a linha de base e integrar os espectros 2D, o que reduz o ruído de fundo. Deve-se observar que o tempo de varredura e o número de varreduras podem variar de um experimento para outro. Além disso, os métodos para correção da linha de base também podem variar de um software para outro.Para iniciar o desacoplamento de Enos, remova o meio do segundo poço da placa de seis poços e lave as células duas vezes com um mililitro de DPBS. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução preparada de Syn one 0,5 milimolar e complete o volume até dois mililitros com DPBS contendo 10% de FBS. Incube as células por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 após a incubação.Lave as células duas vezes com DPBS. Em seguida, adicione 210 microlitros de sulfato ferroso hepta-hidratado recém-preparado, a 2,8 milimolar, e 210 microlitros de MGD a 19,6 milimolar preparado recém segundo o procedimento anterior. A seguir, adicione 4,6 microlitros de íon cálcio quatro a 1,9 milimolar e misture novamente a solução.Como antes, incubar as células a 37 graus Celsius por 36 minutos. Após 36 minutos, coletar o sobrenadante que se deposita em um tubo einor e transferir para uma célula plana EPR. Registrar os espectros de RPE utilizando os mesmos parâmetros de aquisição que antes, após a aquisição.Processe os dados da mesma maneira anteriormente ao início deste protocolo. Prepare uma solução estoque de um molar de DMPO e PBS contendo DTPA 0,1 milimolar. Em seguida, prepare uma solução de um miligrama por mililitro de quatro por 12.Acetato de miframida 13 ou PMA em DMSO: faça alíquotas de um mililitro da solução estoque de PMA diluindo-a para 10 microgramas por mililitro em PBS em um tubo einor contendo um miligrama por mililitro de D-glucose e um miligrama por mililitro de albúmina. Obtenha cinco a seis milhões de células de PMN por mililitro pipetando para cima e para baixo em um tubo einor de 1,5 mililitro. Prepare uma mistura com volume final de 60 microlitros contendo aproximadamente 1,6 vezes 10 à sexta potência de células de PMN, 10 milimolar de DMPO e 0,2 microgramas por mililitro de PMA.Neste experimento, utilizaremos um espectrômetro de banda X Bruker ESP 300. Transfira a solução para uma cubeta plana de RPE e, em seguida, coloque a cubeta na cavidade de RPE. Insira os parâmetros de aquisição de RPE: campo central de 3.486 g, amplitude de modulação de 0,5 g e frequência de 9,8 gigahertz.Como os parâmetros variam de um instrumento para outro e de acordo com as condições experimentais, consulte o texto para conhecer os demais parâmetros utilizados neste experimento para a aquisição de espectros. Nesta demonstração, mostramos a detecção de radicais livres de óxido nítrico e de peróxido SU utilizando dois capturadores de spin diferentes: o ferro MGD e o DNPO.Mostramos que a estimulação de células endoteliais com íon cálcio quatro produz óxido nítrico e que o tratamento com visto um. Um doador de nitrito perina pode reduzir a produção de óxido nítrico, uma estimulação de neutrófilos, no entanto, com PMA na presença de um captador de spin nitro produz um radical hidroxila ADDA ao invés do óxido S devido à instabilidade do aduto de superóxido inicialmente formado. Embora os mecanismos de captura de spin por ferro mg d nitrosos sejam fundamentalmente os mesmos, a adição de óxido nítrico ao ferro MGD envolve uma taxa de reação lenta e que a forma do aduto de óxido nítrico com ferro MGD é muito estável.Na verdade, é possível congelar a solução a menos 80 graus centígrados para aquisição posterior do espectro de RPE sem diminuição significativa na intensidade do sinal de RPE. Por outro lado, a detecção de óxido utilizando o captador de spin nitro é lenta, exigindo concentrações mais elevadas do captador de spin em comparação com o análogo ferro MGD para detecção de óxido nítrico.Várias abordagens têm sido empregadas para detectar com sucesso a forma do aduto de superóxido, a qual não demonstramos mais neste vídeo. O uso de uma cubeta plana, por exemplo, pode proporcionar maior intensidade do sinal de aduto de superóxido devido à maior densidade celular. Encorajo você a consultar o texto sobre este assunto.Além disso, em vez de usar DMPO, pode-se empregar um agente de captura de spin certificado, como BMPO e VMP ou o Nitro DAP MPO fosforilado, que pode gerar adutos de peróxido SU mais persistentes. O uso de ciclodextrina também tem sido empregado para estabilizar os adutos de peróxido SU ao utilizar a captura de spin para detecção de US. Recomenda-se fortemente a aquisição imediata do espectro de EP logo após a geração de superóxido SU.Portanto, a detecção de óxido nítrico utilizando ferro MGD é muito mais eficiente, e o principal desafio atual que enfrenta o aprisionamento de spin por PR do superóxido é alcançar as características observadas na formação do aduto de óxido nítrico com ferro MGD. Ou seja, reatividade rápida ao superóxido e formação de adutos estáveis. Os esforços no desenvolvimento de armadilhas de spin com alta reatividade ao superóxido e formação de spins estáveis estão agora sendo realizados em nosso laboratório e também por outros grupos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

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Aprenda a detectar óxido nítrico e ânion superóxido em células usando espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica com armadilhas para spins. Este método permite identificar espécies reativas implicadas em doenças.

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Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

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