Name: Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprenda a detectar óxido nítrico e ânion superóxido em células usando espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica com armadilhas para spins. Este método permite identificar espécies reativas implicadas em doenças.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH National Heart, Lung, and Blood Institute concessão RO1 HL81248.

1. Cultura de Células endoteliais de aorta bovina (BAEC) <ol><li> Técnicas adequadas de assepsia foram seguidos. </li><li> Num meio de água do banho quente, sem antibióticos, a 37 ° C. </li></ol> Nota: O meio consiste em fenol meio Dulbecco modificado por Eagle livre (DMEM) com 4,5 g / L D-glucose, 4 mM de L-glutamina, 1% de não-aminoácidos essenciais, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 2,5 mg / L o factor de crescimento endotelial. <ol start="3"><li> Remover as células T75 balão contendo a partir da incubadora e limpar a superfície do balão com etanol 70% antes de colocá-lo dentro do capuz. </li><li> Remover o meio antigo usando um aspirador e lavar duas vezes com 5 ml de fosfato de Dulbecco tampão salina (DPBS). </li><li> Adicionar 2 ml de tripsina e esperar por 4-5 min para as células a separar enquanto periodicamente inspeccionar sob o microscópio. </li><li> Adicionar 3 ml do meio de misturar e repetidamente, utilizando uma pipeta de t separadoele células e criam uma suspensão mesmo. </li><li> Transferir 5 ml de meio com tripsina para um tubo de 15 ml e centrifugar a 121 g durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante utilizando um aspirador. Adicionar 5 ml de DPBS e misture bem. Centrifugar a 121g durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e re-suspender o sedimento de células por adição de 6 ml de meio. </li><li> Em uma placa de 6 poços, adicionar 1 ml da suspensão de células a cada poço, em seguida, adicionar 1 ml de meio. Misturar a suspensão utilizando uma pipeta. </li><li> Rotular o placa e incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 2A. Detecção de NO com Cell BAEC <ol><li> Técnicas adequadas de assepsia foram seguidos. </li><li> Remova a placa de 6 poços da incubadora e aspirar o meio a partir do primeiro poço. Lave as células duas vezes com DPBS 1 ml. </li><li> Adicionar 210 uL de 1,9 mM de sulfato de ferro hepta-hidratado (II) (FeSO 4 .7 H2O, preparar recentemente por dissolução de 0,8 mg em1 ml com DPBS CaCl2 e MgCl2) e uL 210 de amónio de N-metil-D-glucamina ditiocarbamato (DGM, preparar recentemente por dissolução de 2,7 mg em 500 ul com DPBS CaCl2 e MgCl 2) utilizando um rácio de 1:7 . (Nota:. Este rácio onde MGD excesso é usado tem sido convencionalmente empregue para a preparação de Fe 2 +-MGD complexa devido ao facto de que o rendimento do Fe 3 +-MGD é maximizada na presença de excesso de MGD A adição de ascorbato em solução para estabilizar o Fe 2 +-MGD não é necessário uma vez que a NO-3 Fe +-MGD formado é endogenamente reduzido para o EPR ​​detectável NO-Fe 2 +-MGD por ascorbato, hidroquinona, ou cisteína com uma eficiência de conversão de até a 99,9% .. O estado diamagnético baixo spin de Fe 2 + permite a detecção de NO utilizando células plana ou tubo capilar, sem a necessidade de um dispositivo de baixa temperatura) 15. </li><li> Swirl a suspensão resultante bem e acrescente 4,6 μl de ionóforo de cálcio (CAI) (preparado a partir de uma solução stock de 1,9 mM por dissolução de 1 mg em 1 ml de DMSO). </li><li> Solução Agitar o novo e incubar a 37 ° C durante 36 min, a fim de permitir ainda mais redução de NO-Fe 3 +-MGD para o EPR ​​detectável NO-Fe 2 +-MGD. </li><li> Recolher o sobrenadante (425 ul) em um tubo de Eppendorf e transferência para uma célula de EPR plana (ou para um tubo de 50 uL capilar). </li><li> Parâmetros de aquisição EPR ​​são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3427 G; modulação de amplitude: 6,0 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 1 x 10 5; potência de microondas: 10 mW; número total de verificações: 121; tempo de varredura: 10 s; tempo e constante: 20 ms (Nota: Uma vez que os parâmetros variam de um instrumento e condições experimentais para outro, portanto, apenas o campo de centro, a freqüência ea modulação de amplitude são os parâmetros mais importantes a considerar.). </li><li> Gravar os espectros à temperatura ambiente e os espectros de 2-D foram integclassificado para reduzir o ruído de fundo ea linha de base corrigido usando Bruker WinEPR software de processamento de dados ou software de processamento de dados. Para a quantificação de formação de aduto, parcelas padrão de concentração versus intensidade de sinal (ou área) pode ser construída usando um SNAP dador NO. </li></ol> 2B. eNOS Experiment Desacoplamento <ol><li> Remova a placa de 6 poços da incubadora e aspirar o meio a partir do segundo poço e lavar duas vezes com DPBS 1 ml. </li><li> Um doador de peroxinitrito, 5-amino-3-(4-morfolinil) -1,2,3-oxadiazolium cloreto de (SIN-1) foi utilizado para desacoplar eNOS 16. Adicionar 100 uL de 0,5 mm de SIN-1 (M r 206,6 g / mol, a partir de 10 mM de solução stock preparada por dissolução de 1 mg de SIN-1 em 500 ul de PBS sem iões Ca / Mg) e diluído para 2 ml com DPBS e 10% de FBS. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Retirar a placa da incubadora e lavar duas vezes com DPBS. </li><li> Adicionar 210 uL de2,8 mM de FeSO 4 .7 H2O e 210 uL de 19,6 mM MGD recém-preparado de acordo com o procedimento acima mencionado. </li><li> Solução redemoinho e adicionar 4,6 ul de 1,9 mM CAI. </li><li> Solução Agitar o novo e incubar a 37 ° C durante 36 min. </li><li> Recolher o sobrenadante (425 ul) em um tubo de Eppendorf e transferência para uma célula de EPR plana. </li><li> Parâmetros de aquisição EPR ​​são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3427 G; modulação de amplitude: 6 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 1 x 10 5; potência de microondas: 10 mW; número total de verificações: 121; tempo de varrimento: 10 s; e constante de tempo: de 20 ms. </li><li> Gravar os espectros e os espectros de 2-D foram integradas para reduzir o ruído de fundo e de linha de base corrigido como mencionado acima. </li></ol> 3. Detecção de O 2 • - a partir de neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) <ol><li> Os neutrófilos foram isolados a partir de amostra de sangue humano, como descrito anteriormente 17. </li><li> Fazer uma solução stock de 1 M DMPO * em PBS contendo 0,1 mM de dietilenotriamina-pentacético ácido (DTPA). DMPO tem um ponto de fusão de 25-29 ° C por isso é mais conveniente para pipetar DMPO líquido (densidade ~ 1,02 g / ml a 25 ° C) para um frasco de vidro (Nota: não utilizar frascos de plástico para a pesagem de desde DMPO puro reage com plástico). Congelado DMPO pode ser derretido, executando água morna para o frasco (Nota: não correr água quente como DMPO pode se decompor). </li><li> É importante a utilização de elevada pureza DMPO (&gt; 99%) desde algumas das armadilhas de spin comercialmente disponíveis contêm impurezas paramagnéticas, e portanto, é imperativo para executar espectro EPR de apenas a solução DMPO por si só (10 mM, neste caso). É crítico que nenhum sinal de fundo é evidente (ver Figura 3A). </li><li> Preparar solução de reserva (1 mg / ml) de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) em DMSO. Fazer alíquotas por diluição da solução a 10 ug / ml em PBS. </li><li> Em um 1.5 ml tubo Eppendorf, preparar uma solução com um volume total de 0,6 ml, seguindo a sequência da adição: ~ 10 6 células por ml de PMN, D-glucose (1 mg / ml) e albumina (1 mg / ml), 10 mM DMPO e 0,2 ug / ml de PMA. (Nota: PMA é o activador de radicais e deve ser adicionado por último). </li><li> Transferir a solução para uma célula de EPR plana. </li><li> Parâmetros de EPR condições de aquisição são: freqüência de microondas: 9,8 GHz; centro do campo: 3486 G; modulação de amplitude: 0,5 G; largura de varredura: 100 G; ganho do receptor: 5 x 10 5; número total de exames: 10; tempo de varredura: 30 s ; potência de microondas: 20 mW; e constante de tempo: ms 81. Para a quantificação de formação de aduto, parcelas padrão de concentração versus intensidade de sinal (ou área) pode ser construída usando os nitróxidos estáveis, tais como TEMPO ou 3-carboxílico-PROXYL. </li></ol> * Nota importante sobre a utilização de DMPO: Ao utilizar uma célula plana, pode-se aumentar a densidade de células, e assim aumentar o sinalintensidade do aducto de rotação, mas a meia-vida de O 2 • - aducto de DMPO é curto (t 1/2 ~ 1 min), que se decompõe para DMPO-OH. DMPO podem ser substituídos usando as mesmas concentrações de Empo, BMPO ou DEPMPO que estão disponíveis comercialmente para a estabilidade aumentada aducto com t 1/2 ~ 8 e 14 min, respectivamente. 4. Os resultados representativos Girar aprisionamento de NO radical foi realizada utilizando Fe 2 +-MGD 2A. Figura e 2B mostram nenhum sinal EPR de Fe 2 +-MGD ou mistura de Fe 2 +-MGD com a CAI, indicando que nenhum sinal de fundo NO origina a partir destes reagentes. BAEC após estimulação com a CAI, que liberta NO reage com o Fe 2 +-MGD para formar o aducto de rotação, NO-Fe 2 +-MGD, e mostra um sinal tripleto característica com valor hiperfina separação (hfsc) constante de uma N = 12,66 G e fator g de g = 2,040. (Figura 2C). O hfvalor sc foi determinada utilizando o programa de simulação WINSIM que pode ser baixado do site NIEHS Banco de Dados Software EPR. O hfsc experimental é consistente com o valor da literatura de um N = 12,70 G e G = 2,041 18 para o NO Fe-2 +-MGD aduto. Do mesmo modo, o efeito de SIN-1 em BAEC baixou a produção de NO, devido à eNOS desacoplamento como mostrado na Figura 2D. DMPO armadilha de spin foi usado para O 2 • - detecção. DMPO por si só não deu um sinal conforme mostrado nas Figuras 3A e confirmação de que a armadilha de rotação é livre de impurezas paramagnéticas. A Figura 3B é o espectro de DMPO e PMNs apenas, e da mesma forma, não há sinal detectável, sugerindo que o DMPO não causar activação do NADPH oxidase enzima. A Figura 3C mostra o sinal observado EPR ​​após estimulação de PMN por PMA. Os valores hfsc para este sinal foram determinados como sendo um N = 14,71 G, um ebeta-H = 11,40 G e uma γ-H = 1,25 G, e são consistentes com os valores na literatura de um N = 14,3 G, uma β-H = 11,7 G e uma γ-H = 1,3 G 19 para DMPO-ó 2 aducto H. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 1"> Figura 1. Fluxograma para a detecção de radicais a partir de neutrófilos e BAEC utilizando armadilhas de spin de EPR. (A) PMNs foram misturados com DMPO e PMA, ea mistura resultante transferida para uma célula de EPR plana para aquisição de dados. (B) BAEC foram cultivadas numa placa, e lavou-se com DPBS. A rotação armadilha Fe (MGD) 2 foi adicionado juntamente com CAI. A solução foi misturada cuidadosamente e incubados. A mistura foi transferida para uma célula de EPR plana para a EPR aquisição de dados. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> Figura 2. Detecção EPR ​​de NO a partir de BAEC. (A) Espectro de Fe 2 +-MGD apenas (B) Espectro de Fe 2 +-MGD + CAI só. (C) Espectro de Triplet resultante a partir do NO aprisionamento por Fe 2 +-MGD usando CAI-estimulado células. (D) Espectro mostrando diminuição da produção de NO devido a 0,5 mM SIN-1 o tratamento de células. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 3"> Figura 3. Detecção EPR ​​de H 2 DMPO-O a partir de neutrófilos activados. (A) Espectro de 10 mM DMPO só. (B) Espectro de PMN sozinho na presença de 10 DMPO mM. (C) Espectro de PMN activado por PMA, na presença de 10 DMPO mM.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

EPR aprisionamento de rotação tem sido empregada em uma ampla variedade de aplicações biomédicas para quantificar e identificar os radicais livres. Aprisionamento de rotação é altamente sensível, capaz de detectar os radicais em concentrações que variam de nM a iM, tornando-o adequado para aplicação em sistemas biológicos. A formação do aduto paramagnético, NO-Fe 2 +-MGD, é a base de NO a detecção através de EPR. Fe 2 +-MGD reage com NO rapidamente 18 a uma taxa de ~ 10 6</...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Fenol meio DMEM livre Alta glicose 1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminoácidos não essenciais </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de crescimento endotelial </td><td> Millipore </td><td> 02-102 </td><td></td></tr><tr><td> CAI </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> A-23187 </td><td> Dissolve-se em DMSO </td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td> Dojindo Laboratories </td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td> FeSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 215.422-250G </td><td> Dissolve-se em PBS com Ca e Mg </td></tr><tr><td> MGD </td><td> Enzo Ciências da Vida </td><td> ALX-400-014-M050 </td><td> Dissolve-se em PBS com Ca 2 + e Mg 2 + </td></tr><tr><td> Células BAEC </td><td> Cell Systems </td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS com CaCl2 e MgCl 2 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol miristato-acetato (PMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 79346-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de Óxido nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Azoto reactivo / espécies de oxigénio (ROS / RNS) a baixas concentrações desempenhar um papel importante na regulação da função celular, de sinalização, e da resposta imune, mas em concentrações não regulados são prejudiciais para a viabilidade da célula 1, 2. Embora os sistemas vivos evoluíram com mecanismos de defesa antioxidantes endógenos e dietético para regular ROS geração, ROS são produzidos continuamente como natural, através da sub-produtos do metabolismo normal de oxigénio e pode causar danos oxidativos a biomoléculas, resultando em perda da função da proteína, a clivagem de ADN, ou lípido peroxidação 3, e, finalmente, ao estresse oxidativo levando a lesão ou morte celular 4. Anião radical superóxido (O2 • -) é o principal precursor de algumas das espécies mais altamente oxidantes conhecidos de existir em sistemas biológicos, tais como o peroxinitrito e radical hidroxilo. A geração de O 2 • - sinaliza o primeiro sinal de explosão oxidativa e, portanto, idetecção st e / ou a apreensão em sistemas biológicos é importante. Nesta demonstração, O 2 • - foi gerada a partir de neutrófilos (PMN). Através da estimulação com quimiotáctica de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), PMN gera O 2 • - através da activação de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidase (NADPH) 5. O óxido nítrico sintase (NO) que vem em três isoformas, como induzível-,-neuronal e endoteliais-SOE, ou iNOS, nNOS ou eNOS, respectivamente, catalisa a conversão de L-arginina a L-citrulina, utilizando NADPH para produzir NO 6 . Aqui, nós gerado NO a partir de células endoteliais. Sob condições de stress oxidativo, eNOS por exemplo, pode mudar de produzir NO para O 2 • - por um processo chamado de desacoplamento, o que se acredita ser causada pela oxidação do heme 7 ou o co-factor, tetrahidrobiopterina (BH 4) 8. Há apenas poucosmétodos fiáveis ​​para a detecção de radicais livres em sistemas biológicos, mas estão limitados por especificidade e sensibilidade. Aprisionamento de rotação é vulgarmente utilizado para a identificação de radicais livres e envolve a reacção de adição de um radical de uma armadilha de spin formando um aducto de spin persistente que pode ser detectado por espectroscopia de ressonância paramagnética electrónica (EPR). Os aductos vários radicais apresentam espectro característico que pode ser usado para identificar os radicais sendo geradas e pode fornecer uma grande quantidade de informação sobre a natureza e da cinética da produção de radical 9. As nitronas cíclicas, 5,5-dimetil-pirrolina-N-óxido, DMPO 10, o DEPMPO fosforilo-substituído 11, eo éster-substituído, Empo 12 e BMPO 13, têm sido largamente utilizados como armadilhas de spin - o spin último armadilhas exibindo mais uma meia-vida de O 2 • - aduto. Ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe (DMG) 2 &lt;/&gt; Sub é vulgarmente usado para prender NO devido à elevada taxa de formação de aduto ea estabilidade elevada do adueto de rotação 14.

Electron paramagnético espectroscopia de ressonância (EPR) foi utilizado para detectar o óxido nítrico a partir de células endoteliais de aorta bovina e anião radical superóxido por neutrófilos humanos, utilizando ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe (DMG)<sub&gt; 2</sub&gt; E 5,5-dimetil-1-pyroroline-N-óxido, DMPO, respectivamente.

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Espécies reativas de nitrogênio/oxigênio (RNS/ROS) em baixas concentrações desempenham um papel importante na regulação da função celular, da sinalização e da resposta imunitária, mas em ...

Sou Frederick Dina, e sou professor associado de farmacologia aqui na Universidade Estadual de Ohio. Nesta demonstração, mostraremos a detecção de óxido nítrico e superóxido em células utilizando EPR com aprisionamento de spin.As espécies reativas de oxigênio e nitrogênio estão implicadas no desenvolvimento de diversas doenças, e por isso sua detecção em sistemas biológicos é de importância fundamental. Poucos métodos confiáveis para a detecção de espécies reativas têm sido empregados em sistemas biológicos, mas eles são limitados pela especificidade e sensibilidade. A técnica de spin trapping, no entanto, é comumente usada para a identificação de radicais livres e envolve a reação de adição de um radical a um agente capturador de spin nitroso ou a complexos metálicos, formando um aduto de spin persistente, que pode ser detectado por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica ou EPR; os diversos adutos de radicais exibem espectros distintivos que podem ser utilizados para identificar os radicais gerados e podem fornecer uma riqueza de informações sobre a natureza e a cinética da produção de radicais.A óxido nítrico sintase catalisa a conversão de L-arginina em L-citruli

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um método para escala mícron imagem tridimensional da concentração de oxigênio no ambiente imediato de células vivas por microscopia eletrônica de spin ressonância.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

Spin-trapping espectroscopia ESR foi usado para estudar o efeito de antioxidantes vegetais licopeno, pycnogenol e extrato de semente de uva na limpeza de fase gasosa de radicais livres na fumaça do cigarro.

Um Protocolo para Detecção e eliminação em fase gasosa radicais livres do fumo do cigarro Mainstream

A produção endógena de óxido nítrico (NO) regula uma grande variedade de funções biológicas. Está se tornando cada vez mais claro que a ruptura ou desregulagem de sinalização NO base está envolvida em muitas doenças humanas. Os métodos para quantificar relevante metabólitos podem fornecer novos biomarcadores de diagnóstico ou de prognóstico para a doença humana.

Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil adaptados usando o corante de fluorescência diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) para en face detecção simultânea e visualização de óxido nítrico intracelular (NO) e ânion superóxido (O 2 .- ), respectivamente, em aortas isoladas de fresco intactas de um modelo de rato de obesidade.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Um novo método de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), rápidas digitalização EPR (RS-EPR), é demonstrado para 2D imagens espaciais espectral, que é superior à técnica tradicional de onda contínua (CW) e abre novos espaços para imagiologia in vivo. Os resultados são demonstrados a 250 MHz, mas a técnica é aplicável em qualquer frequência.

Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes<em&gt; In Vivo</em

Espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR) de elétrons é um método inequívoco para medir radicais livre. A utilização de sondas de rotação seletiva permite detecção de radicais livres em diferentes compartimentos celulares. Apresentamos um método prático e eficiente para coletar amostras biológicas que facilitam a tratar, armazenar e transferir amostras para medições de EPR.

Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K

Este protocolo descreve a configuração de um bioreator NMR para manter as células humanas encapsuladas viáveis por até 72 h, seguida por aquisição e análise de dados NMR resolvidos no tempo. A metodologia é aplicada para monitorar interações proteína-ligantes intracelulares em tempo real.

Monitoramento de interações proteína-ligantes em células humanas por NMR quantitativo em tempo real usando um bioreator de alta densidade celular

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Aqui, propomos um protocolo sistematizado, acessível e reprodutível para detectar espécies de oxigênio reativa celular (ROS) usando uma sonda diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) em células gliais Müller (MGCs). Este método quantifica os níveis ros celulares totais com um citómetro de fluxo. Este protocolo é muito fácil de usar, adequado e reprodutível.

Quantificação de espécies reativas de oxigênio usando 2′,7′-Sonda diacetato de diclorofluoresceína e flução-citometria em células gliais Müller

A geração de ânion superóxido é essencial para a estimulação das plaquetas e, se desregulada, crítica para doenças trombóticas. Aqui, apresentamos três protocolos para a detecção seletiva de ânions superóxido e o estudo da regulação plaquetária dependente de redox.

Métodos alternativos para a detecção da geração de ânions superóxido em plaquetas 

Aprenda a detectar óxido nítrico e ânion superóxido em células usando espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica com armadilhas para spins. Este método permite identificar espécies reativas implicadas em doenças.

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Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

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