Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Sou Frederick Dina, e sou professor associado de farmacologia aqui na Universidade Estadual de Ohio. Nesta demonstração, mostraremos a detecção de óxido nítrico e superóxido em células utilizando EPR com aprisionamento de spin.

As espécies reativas de oxigênio e nitrogênio estão implicadas no desenvolvimento de diversas doenças, e por isso sua detecção em sistemas biológicos é de importância fundamental. Poucos métodos confiáveis para a detecção de espécies reativas têm sido empregados em sistemas biológicos, mas eles são limitados pela especificidade e sensibilidade. A técnica de spin trapping, no entanto, é comumente utilizada para a identificação de radicais livres e envolve a reação de adição de um radical a um agente capturador de spin nitroso ou a complexos metálicos, formando um aduto de spin persistente, que pode ser detectado por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica ou EPR. Os diversos adutos de radicais exibem espectros distintivos que podem ser usados para identificar os radicais gerados e podem fornecer uma rica informação sobre a natureza e a cinética da produção de radicais.

A óxido nítrico sintase catalisa a conversão de L-arginina em L-citrulina utilizando NADPH para produzir óxido nítrico. Sob condições de estresse oxidativo, a eNOS pode alternar da produção de óxido nítrico para superóxido em um processo denominado desacoplamento, que acredita-se ser causado pela oxidação do grupo heme ou do cofator tetrahidrobiopterina. A regulação do óxido nítrico em sistemas biológicos é importante, pois desempenha um papel crítico na sinalização celular, resultando em funções fisiológicas benéficas, como vasodilatação, mas sua superprodução está frequentemente associada a condições inflamatórias. Portanto, a detecção de óxido nítrico em sistemas biológicos é importante.

Outra classe importante de moléculas sinalizadoras em sistemas biológicos são as espécies reativas de oxigênio, como o óxido nítrico. As espécies reativas de oxigênio, em baixas concentrações, desempenham um papel importante na regulação da função celular, sinalização e resposta imune, mas, em concentrações não reguladas, podem levar a danos oxidativos celulares, resultando em estresse oxidativo. O ânion radical superóxido é uma das espécies reativas de oxigênio mais importantes e é o principal precursor de algumas das espécies mais fortemente oxidantes conhecidas em sistemas biológicos, como o peróxido de nitrito e o radical hidroxila. A detecção e/ou sequestro do superóxido em sistemas biológicos é, portanto, importante, pois sua geração sinaliza o primeiro indício de explosão oxidativa antes do início.

Este protocolo trypsiniza olhos com células endoteliais aórticas bovinas cultivadas conforme descrito no procedimento escrito. Transfira as células para uma placa de seis poços rotulada e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5%CO2 após a incubação.

Remova a placa de seis poços do incubador e aspire o meio do primeiro. Lave as células duas vezes com um mililitro de solução tampão salina fosfato de delcos ou DPBS. Prepare uma solução de sulfato de ferro heptaidratado 1,9 milimolar adicionando 0,8 miligramas de sulfato de ferro a um mililitro de DPBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.

E prepare a solução de MGD adicionando 2,7 miligramas de MGD de amônio a 500 microlitros de DPBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio. Adicione 210 microlitros de sulfato ferroso heptaidratado recém-preparado a 1,9 milimolar e 210 microlitros de MGD recém-preparado usando uma proporção molar de um para sete e misture a suspensão resultante. Adicione 4,6 microlitros de íon cálcio quatro e misture novamente a solução pipetando para cima e para baixo.

Em seguida, incubar a amostra a 37 graus Celsius por 36 minutos. Coletar o sobrenadante que se deposita em um tubo einor. Inserir os parâmetros de aquisição de RPE: campo central de 34,27 goss, amplitude de seis goss e frequência de 9,8 gigahertz.

Como os parâmetros variam de um instrumento e condição experimental para outro, consulte o texto para obter outros parâmetros utilizados neste equipamento. Transfira o super natin para uma célula plana de RPE, feche com parafina e coloque na cavidade de RPE. Registre os espectros por aproximadamente 21 minutos, com 121 varreduras e 10,4 segundos por varredura, após a execução do experimento.

Utilize o processamento de EPR da Bruker WIN para corrigir a linha de base e integrar os espectros 2D, o que reduz o ruído de fundo. Deve-se observar que o tempo de varredura e o número de varreduras podem variar de um experimento para outro. Além disso, os métodos para correção da linha de base também podem variar de um software para outro.

Para iniciar o desacoplamento de Enos, remova o meio do segundo poço da placa de seis poços e lave as células duas vezes com um mililitro de DPBS. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução preparada de Syn one 0,5 milimolar e complete o volume para dois mililitros com DPBS contendo 10% de FBS. Incube as células por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 após a incubação.

Lave as células duas vezes com DPBS. Em seguida, adicione 210 microlitros de sulfato ferroso hepta-hidratado recém-preparado, a 2,8 milimolar, e 210 microlitros de MGD a 19,6 milimolar preparado recém segundo o procedimento anterior. A seguir, adicione 4,6 microlitros de íon cálcio quatro a 1,9 milimolar e misture novamente a solução.

Como antes, incubar as células a 37 graus Celsius por 36 minutos. Após 36 minutos, coletar o sobrenadante que se deposita em um tubo einor e transferir para uma célula plana EPR. Registrar os espectros de RPE usando os mesmos parâmetros de aquisição que antes, após a aquisição.

Processe os dados da mesma maneira anteriormente ao início deste protocolo. Prepare uma solução estoque de um molar de DMPO e PBS contendo DTPA 0,1 milimolar. Em seguida, prepare uma solução de um miligrama por mililitro de quatro por 12.

Acetato de miframida 13 ou PMA em DMSO: faça alíquotas de um mililitro da solução estoque de PMA diluindo-a para 10 microgramas por mililitro em PBS em um tubo einor contendo um miligrama por mililitro de D-glucose e um miligrama por mililitro de albumina. Obtenha cinco a seis milhões de células de PMN por mililitro pipetando para cima e para baixo em um tubo einor de 1,5 mililitro. Prepare uma mistura com volume final de 60 microlitros contendo aproximadamente 1,6 vezes 10 à sexta potência de células de PMN, 10 milimolar de DMPO e 0,2 microgramas por mililitro de PMA.

Neste experimento, utilizaremos um espectrômetro de banda X Bruker ESP 300. Transfira a solução para uma cubeta plana de RPE e, em seguida, coloque a cubeta na cavidade de RPE. Insira os parâmetros de aquisição de RPE: campo central de 3.486 g, amplitude de modulação de 0,5 g e frequência de 9,8 gigahertz.

Como os parâmetros variam de um instrumento para outro e de acordo com as condições experimentais, consulte o texto para obter os demais parâmetros utilizados neste experimento para a aquisição de espectros. Nesta demonstração, mostramos a detecção de óxido nítrico e radicais de peróxido SU utilizando dois spin traps diferentes: o ferro MGD e o DNPO.

Mostramos que a estimulação de células endoteliais com íon cálcio quatro produz óxido nítrico e o tratamento com visto um. Um doador de nitrito perina pode reduzir a produção de óxido nítrico, uma estimulação de neutrófilos, no entanto, com PMA na presença de um captador de spin nitro produz um radical hidroxila ADDA ao invés do óxido S devido à instabilidade do aduto de superóxido inicialmente formado. Embora os mecanismos de captura de spin por ferro mg d nitrosos sejam fundamentalmente os mesmos, a adição de óxido nítrico ao ferro MGD envolve uma taxa de reação passiva e que a forma do aduto de óxido nítrico com ferro MGD é muito estável.

De fato, é possível congelar a solução a menos 80 graus centígrados para a aquisição posterior do espectro de RPE sem diminuição significativa na intensidade do sinal de RPE. Por outro lado, a detecção de óxido utilizando o captador de spin nitro é lenta, exigindo concentrações mais elevadas do captador de spin em comparação com o análogo ferro MGD para detecção de óxido nítrico.

Várias abordagens foram empregadas para detectar com sucesso a forma do aduto de superóxido, a qual não demonstramos mais neste vídeo. O uso de uma cubeta plana, por exemplo, pode proporcionar maior intensidade do sinal de aduto de superóxido devido à maior densidade celular. Encorajo você a consultar o texto sobre este assunto.

Além disso, em vez de utilizar DMPO, pode-se empregar um agente de captura de spin certificado, como BMPO e VMP ou o MPO Nitro DAP fosforilado, que pode gerar adutos de peróxido SU mais persistentes. O uso de ciclodextrina também tem sido empregado para estabilizar os adutos de peróxido SU ao utilizar a captura de spin para detecção de US. Recomenda-se fortemente a aquisição imediata do espectro de RE logo após a geração de superóxido SU.

Portanto, a detecção de óxido nítrico utilizando ferro MGD é muito mais eficiente, e o principal desafio atual que enfrenta o aprisionamento de spin por PR do superóxido é alcançar as características observadas na formação do aduto de óxido nítrico com ferro MGD. Ou seja, reatividade rápida ao superóxido e formação de adutos estáveis. Os esforços no desenvolvimento de armadilhas de spin com alta reatividade ao superóxido e formação de spins estáveis estão agora sendo conduzidos em nosso laboratório e também por outros grupos.