Name: Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco hematopoéticas em eritrócitos maduros ex vivo usando vetores lentivirais para knockdown do fator de transcrição TAL1. Este método permite estudar mecanismos moleculares da eritropoiese humana.

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Agradecemos a L. Douay e MC Giarratana (Université Paris VI, França) para aconselhamento sobre a diferenciação eritróide ex vivo, D. Allan H. e Atkins (Ohri, Canadá) para fornecer amostras de sangue (obtida no âmbito do Hospital Ottawa Conselho de Ética em Pesquisa # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) para fornecer os vetores lentiviral e FJ Dilworth (Ohri, Canadá) pela leitura crítica do manuscrito. Este projeto foi financiado por uma doação CIHR (MOP-82813) para MBCGP é um receptor de uma Bolsa de Investigação do Fundo de Treinamento Ontario Computacional Regulomics Pós-Doutorado. MB detém a Cátedra de Pesquisa do Canadá na regulação da expressão gênica.

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<li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li>
<li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um certo número de métodos têm sido utilizados anteriormente para diferenciar células eritróides em cultura, com graus variáveis ​​de sucesso. Por exemplo, alguns protocolos, sem co-cultura em MS-5 permite a expansão de células eritróides, mas não são eficientes na produção de plena maturidade enucleados glóbulos vermelhos 12-17. Enquanto outros métodos permitem enucleação eficiente, é à custa de proliferação 18,19. O método que usamos aqui, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay 6,<...

lentivirus mediada durante knockdown ex vivo eritropoese de células-tronco hematopoéticas

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Eritropoiese é um sistema modelo comumente usado para estudar a diferenciação celular. Durante a eritropoiese, pluripotentes humano adulto células-tronco hematopoéticas (HSCs) diferenciar em progenitores oligopotent, precursores e glóbulos vermelhos maduros 1. Este processo é regulado por uma grande parte ao nível da expressão gênica, em que fatores de transcrição específicos ativar genes de linhagem específica, enquanto concomitantemente reprimindo genes que são específicos para outros tipos de células 2. Estudos sobre fatores de transcrição que regulam a eritropoiese são frequentemente realizadas usando linhas de células humanas e camundongos, que representam, até certo ponto, as células eritróides, em determinadas fases de diferenciação 3-5. Linhagens de células transformadas no entanto só pode imitar parcialmente células eritróides e mais importante é que eles não permitem que se compreensível estudar as mudanças dinâmicas que ocorrem como células progridem por muitos estágios para o seu destino eritróide final. Portanto, um desafio atual continua a ser o desenvolvimento de um protocolo para obter populações relativamente homogêneas de HSCs primária e células eritróides em vários estágios de diferenciação em quantidades que são suficientes para executar genômica e proteômica experimentos. Aqui nós descrevemos um ex vivo protocolo de cultura de células para induzir a diferenciação eritróide de humano-tronco hematopoiéticas / progenitoras que foram isolados a partir de qualquer sangue do cordão umbilical, na medula óssea ou sangue periférico de adultos mobilizados com G-CSF (leucaférese). Este sistema de cultivo, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay 6, usa citocinas e co-cultura em células mesenquimais para imitar o microambiente da medula óssea. Usando este protocolo diferenciação ex vivo, observamos uma ampliação forte de progenitores eritróides, uma indução de diferenciação exclusivamente para a linhagem eritróide e uma maturação completa para o estágio de enucleados células vermelhas do sangue. Assim, este sistema oferece uma oportunidade para estudar o mecanismo molecular de regulação da transcrição como células-tronco hematopoiéticas progresso ao longo da linhagem eritróide. Estudando eritropoiese no nível de transcrição também requer a capacidade de sobre-expressar ou knockdown fatores específicos em células primárias eritróide. Para este fim, usamos um lentivírus mediada sistema de entrega de gene que permite a infecção eficiente de ambos dividindo e não dividir células 7. Aqui nós mostramos que somos capazes de forma eficiente o knockdown TAL1 fator de transcrição em células primárias de eritróide humana. Além disso, a expressão GFP demonstra uma eficiência de infecção lentiviral cerca de 90%. Assim, o nosso protocolo prevê um sistema altamente útil para a caracterização da rede de regulação de fatores de transcrição que eritropoiese controle.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protocolo para gerar humano maduro glóbulos vermelhos a partir de tronco hematopoiéticas / progenitores é descrito. Além disso, descrevemos um método de entrega-lentiviral eficiente para knockdown do TAL1 fator de transcrição em células primárias eritróide. A eficiência do lentivírus de entrega gene mediada é demonstrada usando vírus GFP expressar.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

A eritropoese é um sistema de modelo comumente utilizado para estudar a diferenciação celular. Durante a eritropoese, células-tronco hematopoiéticas adultas humanas pluripotentes...

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas ao longo da linhagem eritróide e realizar a inibição de um fator de transcrição específico durante a eritropoiese ex vivo. Isso é realizado primeiramente isolando-se células-tronco e progenitoras humanas positivas para CD34 a partir de sangue de cordão umbilical, medula óssea ou sangue periférico mobilizado com GCSF. O segundo passo do procedimento consiste em diferenciar essas células-tronco hematopoiéticas ao longo da linhagem eritróide utilizando um procedimento de cultura celular em quatro etapas, que combina citocinas específicas e cocultivo sobre uma camada de células estromais, visando simular o microambiente da medula óssea.Em seguida, prepare partículas de vetor lentiviral expressando uma molécula HRNA contra o fator de transcrição de interesse, uma molécula HRA embaralhada como controle negativo e a proteína GFP para controlar a eficiência da infecção viral. O passo final do procedimento é infectar células eritroides humanas primárias em um determinado estágio de diferenciação com partículas lentivirais. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram a proliferação celular e a diferenciação eritoide por meio da análise da morfologia celular, da capacidade de formação de colônias dos progenitores, da produção de hemoglobina e da expressão de marcadores eritroides específicos por meio de citometria de fluxo.A eficiência da infecção viral é analisada mediante a medição da expressão de GFP por citometria de fluxo, e a inibição do fator de transcrição de interesse é analisada por R-T-Q-P-C-R. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da hematopoese, como os mecanismos moleculares pelos quais cada fator de transcrição regula a expressão gênica em um ambiente não transformado fornecido por células humanas primárias. Isso é importante para compreender processos fundamentais da hematopoese, tais como determinação linfopoética, proliferação com autorrenovação ou apoptose.Embora este método possa fornecer informações sobre ROIs normais e sua regulação no nível molecular, ele também pode ser usado como um sistema modelo para estudar terapias direcionadas a doenças decorrentes de desequilíbrio, proliferação anormal e diferenciação, incluindo distúrbios mieloproliferativos como a policitemia vera e a leucemia. O protocolo para eritropoese ex vivo de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas em células vermelhas maduras contendo hemoglobina compreende duas etapas: o isolamento de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas positivas para CD34 e a diferenciação eritróide livre de soro em cultura celular. Na primeira etapa, células positivas para CD34 são isoladas de sangue de cordão umbilical, medula óssea ou sangue periférico humano mobilizado com GCSF, utilizando seleção imunológica positiva.O segundo passo da diferenciação eritróide livre de soro envolve o cultivo de células CD34 positivas em cultura líquida. De acordo com um protocolo de quatro etapas adaptado do método inicialmente desenvolvido pelo laboratório DU, do dia zero ao dia 11, as células hematopoiéticas são cultivadas em meio ECCO modificado, suplementado com hidrocortisona, fator de crescimento de células-tronco, interleucina-3 e eritropoetina. Em seguida, do dia 11 ao dia 15, as células eritróides são co-cultivadas sobre células mesenquimais MS5 em meio IMDM suplementado contendo EPO, na etapa três.Após colher as células eritróides de verão para uso futuro, as células restantes são co-cultivadas em células MS5 em meio IMDM suplementado sem citocinas. Por fim, do dia 18 ao dia 26, as células eritróides são concentradas de três a quatro vezes e mantidas em uma camada de células MS5 para permitir a maturação, e 10% de FBS são adicionados ao meio IMDM suplementado para melhor preservação das hemácias cultivadas. Para fins deste artigo em vídeo, demonstraremos apenas o segundo passo da diferenciação eritróide, a co-cultura de células eritróides em células mesenquimais com eritropoietina.O aspecto mais difícil deste procedimento é realizar essas etapas em larga escala, lavando e substituindo o meio do frasco contendo células AUS cinco para co-cultura e, posteriormente, transferindo células art trade para este frasco. Portanto, processamos um frasco por vez e mantemos 2%organ simultaneamente. Para iniciar a co-cultura de células eritróides sobre células mesenquimais com EPO, conte as células eritróides utilizando trian blue para excluir as células mortas.No dia 11, a densidade celular deve ser cerca de 1,5 vezes 10 elevado às seis células por mililitro; reserve cerca de 80 mililitros da cultura de células eritróides para co-cultura com células mesenquimatosas MS5. Preenquente a solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o meio IMDM suplementado, bem como o meio IMDM suplementado contendo EPO, a 37 graus Celsius. Em seguida, retire do incubador quatro dos frascos previamente preparados com células MS5 confluentes.Lave cada frasco com 20 mililitros de XPBS e adicione imediatamente 80 mililitros de meio IM DM suplementado fresco contendo EPO a cada frasco. Mantenha as células no incubador enquanto as células eritróides estão sendo preparadas. Agora, transfira as células eritróides reservadas para dois tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue a 1500 RRP M durante 10 minutos.Após descartar o sobrenatante, lave cada um dos dois pellets celulares com 20 mililitros de meio IMDM suplementado resus, suspenda cada pellet celular em 40 mililitros de meio IMDM suplementado contendo EP. Em seguida, distribua 20 mililitros dessa suspensão celular para cada um dos quatro frascos contendo células MS cinco e 80 mililitros de meio. Neste momento, você deverá ter quatro frascos com células MS cinco confluentes contendo 100 mililitros de células eritróides a 0,3 vezes 10 elevado a seis células por mililitro. No dia seguinte, conte as células eritróides com tripano azul para excluir as células mortas. A densidade celular deverá ser de aproximadamente 0,6 vezes 10 elevado a seis células por mililitro.Colete o número necessário de células para testes que verifiquem a correta proliferação celular e diferenciação eritróide. Estudar a eritropoiese no nível transcricional também exige a capacidade de superexpressar ou silenciar fatores específicos em células eritróides primárias. Neste exemplo, utiliza-se um sistema de entrega gênica mediado por lentivírus para silenciar o fator de transcrição em células eritróides humanas primárias.O protocolo para o preparo de partículas de vetor lentiviral está disponível no manuscrito. Este vídeo demonstrará o procedimento para infecção lentiviral de células eritroides primárias para entrega gênica. Células eritroides nucleadas podem ser infectadas com eficiência em qualquer estágio de diferenciação utilizando uma multiplicidade de infecção de 50 a 100.Aqui, um lentivírus expressando um T um ou um S-H-R-N-A aleatório será usado para infectar células eritróides nos dias oito e nove da diferenciação, utilizando uma MOI de 52 unidades por célula. Para iniciar este procedimento, prepare três tubos cónicos de 15 mililitros contendo um vezes 10 elevado à sexta potência de células eritróides, sendo um tubo para silenciamento de TAL um, um tubo para controle negativo aleatório e um tubo para expressão de GFP. Lave as células-controle com cinco mililitros de meio IMDM suplementado contendo EPO, centrifugue a 1000 RPM durante cinco minutos e remova o máximo possível do sobrenadante.A infecção deve ser realizada com volumes mínimos de meio para permitir a absorção máxima do lentivírus nas células. Adicione polibrena numa concentração final de 40 microgramas por mililitro a cada tubo de lentivírus concentrados. Adicione 100 microlitros do vírus concentrado preparado contendo polibrena a cada tubo de células.Incubar por uma hora no incubador a 37 graus Celsius, misturando com leves toques dos dedos a cada 10 minutos. Isso permite a distribuição uniforme do vírus entre as células ao final da incubação de uma hora com 1,9 mililitros de meio IMDM suplementado contendo EPO em cada tubo. Transferir cada amostra para uma placa de seis poços e colocar no incubador a 37 graus Celsius por 24 horas.Após 24 horas, colete as células em tubos separados de 15 mililitros. Centrifugue-as a 1000 RRP M durante cinco minutos e remova o sobrenadante. Repita a infecção, adicione o vírus e polibrena e incube por uma hora a 37 graus Celsius com batidas leves dos dedos.Em seguida, adicione meio IMDM suplementado contendo EPO às células. Transfira cada amostra para uma placa de seis poços e incube por 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, transfira as células para três tubos cónicos de 15 mililitros e lave por centrifugação, remoção do sobrenadante e ressuspensão das células em meio fresco, seguida de nova centrifugação.Novamente, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em uma concentração de 0,2 vezes 10 elevado às seis células por mililitro em IMDM suplementado contendo EPO. Em seguida, prossiga com o procedimento de diferenciação eritróide; as células são contadas a cada dois dias durante o protocolo de diferenciação eritróide ex vivo. Um resultado representativo em escala logarítmica mostra que as células são altamente proliferativas, conforme ilustrado pela amplificação de 10.000 vezes.Além disso, pode-se observar a joia de Grunwald, de modo que a coloração para morfologia é realizada a cada dois dias, utilizando 0,05 vezes 10 das seis células do dia zero ao oito e 0,2 vezes 10 das seis células nos demais dias. Como ilustrado nesta figura, células em estágios específicos de diferenciação exibem tamanhos e morfologias reconhecíveis. Observe o processo de enucleação que ocorre ao final da diferenciação, a partir do dia 20.No dia 26, todas as células perderam seus núcleos. Ensaios de formação de colônias são utilizados para detectar progenitores hematopoiéticos precoces e tardios durante os primeiros dias de diferenciação, e os resultados são mostrados aqui no dia zero. Além dos progenitores eritroides, progenitores de granulócitos e macrófagos estão significativamente representados entre as células positivas para CD34 iniciais.À medida que a diferenciação progride, observa-se que algumas GM diminuíram significativamente e, no sexto dia, foram completamente substituídas por progenitores eritróides, BFUE e CFUE. É importante também notar que, do quarto ao sexto dia, os progenitores eritróides iniciais, BFUE, são progressivamente substituídos por seus equivalentes mais diferenciados, CFUE. No décimo dia, as células eritróides perderam essencialmente sua capacidade de formar colônias.Mostradas aqui estão imagens típicas de BFUE e CFUE. A cor marrom avermelhada é devida à hemoglobina presente em BFUE e CFUE. A eritropoiese é monitorada durante a diferenciação ex vivo pela coleta de células nos pontos de tempo indicados e pela análise delas por citometria de fluxo ou por microscopia quanto à expressão de marcadores de superfície celular.Aqui, as barras representam porcentagens de células positivas. As observações significativas incluem a perda progressiva do marcador de progenitor de célula-tronco hematopoiética CD 34, a aquisição e perda progressivas do marcador de progenitor CD 36, a aquisição e perda progressivas do marcador eritróide, de progenitor e de reticulócito CD 71, e o aumento do marcador de precursor eritróide e de eritrócito GPA. Outros marcadores de diferenciação eritróide incluem a síntese de hemoglobina a partir do dia oito, medida pela coloração com benzidina, e a enucleação celular a partir do dia 20.Medida pela perda da coloração de DNA LDS, os resultados da transferência gênica mediada por lentivírus em proeritroblastos primários humanos são mostrados a seguir ao silenciamento do fator de transcrição. T um foi mediado por lentivírus que entregou anti T um SHRA ou um SHRA controle aleatorizado; a mensuração da cinética dos níveis de transcritos de mRNA de T um por RT qPCR R e a expressão do transcritos de T um em relação a 18. Srna mostraram que 75% dos transcritos de T um foram efetivamente silenciados em células eritroides primárias.O aumento do nível do transcrito T um do dia nove ao dia 12 e o controle aleatório destacam a importância desse fator de transcrição durante a diferenciação eritróide. Por fim, em outro experimento, células eritróides foram infectadas com lentivírus expressando a proteína GFP. Esta figura mostra que, três dias após a infecção, a maioria das células eritróides está expressando GFP, medido por fluorescência ao microscópio e por citometria de fluxo.Isso indica uma eficiência de infecção em células eritróides primárias próxima a 100% após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de hematopoiese explorarem a regulação da transcrição na eritropoiese humana. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como diferenciar células-tronco e progenitoras hematopoéticas em eritrócitos em cultura, bem como de como utilizar a entrega gênica mediada por lentivírus para induzir uma interrupção gênica eficiente em qualquer estágio desse processo de diferenciação.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos um método para realizar a transdução de vetores lentivirais shRNA para obter linhagens celulares knockdown estáveis em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs).

Nocaute de gene mediado por RNA de grampo curto em iHSPCs in vitro: um sistema de expressão de shRNA baseado em lentivírus em iHSPCs para knockdown de expressão gênica específica

Nós apresentamos um rato fetal sistema de cultura in vitro de eritroblastos fígado que disseca os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Este sistema facilita a análise funcional de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento.

Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

A manipulação da expressão gênica temporal na diferenciação de células-tronco embrionárias (ESCs) pode ser alcançada usando sistemas gênicos induzíveis. No entanto, a geração dessas linhagens celulares é cara e demorada. Este protocolo alcança a expressão rápida de um transgene na diferenciação de células derivadas de ES e subsequente análise da diferenciação hematopoiética a jusante.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Este protocolo demonstra a indução de um programa hemogenic em fibroblastos dérmicos humanos pela expressão forçada dos fatores de transcrição GATA2, GFI1B e FOS para gerar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.

Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

Usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI), produzimos partículas lentivirais para expressão estável de shRNAs em células-tronco embrionárias humanas H9 (hESCs) e células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs) com alta eficiência.

Entrega mediada lentiviral de shRNAs para hESCs e NPCs usando polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI)

A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

Aprenda a diferenciar células-tronco hematopoéticas em eritrócitos maduros ex vivo usando vetores lentivirais para knockdown do fator de transcrição TAL1. Este método permite estudar mecanismos moleculares da eritropoiese humana.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

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