Name: Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco hematopoéticas em eritrócitos maduros ex vivo usando vetores lentivirais para knockdown do fator de transcrição TAL1. Este método permite estudar mecanismos moleculares da eritropoiese humana.

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Agradecemos a L. Douay e MC Giarratana (Université Paris VI, França) para aconselhamento sobre a diferenciação eritróide ex vivo, D. Allan H. e Atkins (Ohri, Canadá) para fornecer amostras de sangue (obtida no âmbito do Hospital Ottawa Conselho de Ética em Pesquisa # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) para fornecer os vetores lentiviral e FJ Dilworth (Ohri, Canadá) pela leitura crítica do manuscrito. Este projeto foi financiado por uma doação CIHR (MOP-82813) para MBCGP é um receptor de uma Bolsa de Investigação do Fundo de Treinamento Ontario Computacional Regulomics Pós-Doutorado. MB detém a Cátedra de Pesquisa do Canadá na regulação da expressão gênica.

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<li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li>
<li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li>
<li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um certo número de métodos têm sido utilizados anteriormente para diferenciar células eritróides em cultura, com graus variáveis ​​de sucesso. Por exemplo, alguns protocolos, sem co-cultura em MS-5 permite a expansão de células eritróides, mas não são eficientes na produção de plena maturidade enucleados glóbulos vermelhos 12-17. Enquanto outros métodos permitem enucleação eficiente, é à custa de proliferação 18,19. O método que usamos aqui, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay 6,<...

lentivirus mediada durante knockdown ex vivo eritropoese de células-tronco hematopoéticas

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Eritropoiese é um sistema modelo comumente usado para estudar a diferenciação celular. Durante a eritropoiese, pluripotentes humano adulto células-tronco hematopoéticas (HSCs) diferenciar em progenitores oligopotent, precursores e glóbulos vermelhos maduros 1. Este processo é regulado por uma grande parte ao nível da expressão gênica, em que fatores de transcrição específicos ativar genes de linhagem específica, enquanto concomitantemente reprimindo genes que são específicos para outros tipos de células 2. Estudos sobre fatores de transcrição que regulam a eritropoiese são frequentemente realizadas usando linhas de células humanas e camundongos, que representam, até certo ponto, as células eritróides, em determinadas fases de diferenciação 3-5. Linhagens de células transformadas no entanto só pode imitar parcialmente células eritróides e mais importante é que eles não permitem que se compreensível estudar as mudanças dinâmicas que ocorrem como células progridem por muitos estágios para o seu destino eritróide final. Portanto, um desafio atual continua a ser o desenvolvimento de um protocolo para obter populações relativamente homogêneas de HSCs primária e células eritróides em vários estágios de diferenciação em quantidades que são suficientes para executar genômica e proteômica experimentos. Aqui nós descrevemos um ex vivo protocolo de cultura de células para induzir a diferenciação eritróide de humano-tronco hematopoiéticas / progenitoras que foram isolados a partir de qualquer sangue do cordão umbilical, na medula óssea ou sangue periférico de adultos mobilizados com G-CSF (leucaférese). Este sistema de cultivo, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay 6, usa citocinas e co-cultura em células mesenquimais para imitar o microambiente da medula óssea. Usando este protocolo diferenciação ex vivo, observamos uma ampliação forte de progenitores eritróides, uma indução de diferenciação exclusivamente para a linhagem eritróide e uma maturação completa para o estágio de enucleados células vermelhas do sangue. Assim, este sistema oferece uma oportunidade para estudar o mecanismo molecular de regulação da transcrição como células-tronco hematopoiéticas progresso ao longo da linhagem eritróide. Estudando eritropoiese no nível de transcrição também requer a capacidade de sobre-expressar ou knockdown fatores específicos em células primárias eritróide. Para este fim, usamos um lentivírus mediada sistema de entrega de gene que permite a infecção eficiente de ambos dividindo e não dividir células 7. Aqui nós mostramos que somos capazes de forma eficiente o knockdown TAL1 fator de transcrição em células primárias de eritróide humana. Além disso, a expressão GFP demonstra uma eficiência de infecção lentiviral cerca de 90%. Assim, o nosso protocolo prevê um sistema altamente útil para a caracterização da rede de regulação de fatores de transcrição que eritropoiese controle.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protocolo para gerar humano maduro glóbulos vermelhos a partir de tronco hematopoiéticas / progenitores é descrito. Além disso, descrevemos um método de entrega-lentiviral eficiente para knockdown do TAL1 fator de transcrição em células primárias eritróide. A eficiência do lentivírus de entrega gene mediada é demonstrada usando vírus GFP expressar.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

A eritropoese é um sistema de modelo comumente utilizado para estudar a diferenciação celular. Durante a eritropoese, células-tronco hematopoiéticas adultas humanas pluripotentes...

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas ao longo da linhagem eritróide e realizar a inibição de um fator de transcrição específico durante a eritropoiese ex vivo. Isso é realizado primeiramente isolando-se células-tronco e progenitoras humanas positivas para CD34 a partir de sangue de cordão umbilical, medula óssea ou sangue periférico mobilizado com GCSF. O segundo passo do procedimento consiste em diferenciar essas células-tronco hematopoiéticas ao longo da linhagem eritróide utilizando um procedimento de cultura celular em quatro etapas, que combina citocinas específicas e cocultivo sobre uma camada de células estromais, visando simular o microambiente da medula óssea.Em seguida, prepare partículas de vetor lentiviral expressando uma molécula HRNA contra o fator de transcrição de interesse, uma molécula HRA embaralhada como controle negativo e a proteína GFP para controlar a eficiência da infecção viral. O passo final do procedimento é infectar células eritroides humanas primárias em um determinado estágio de diferenciação com partículas lentivirais. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram a proliferaçã

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Biologia

Neste vídeo, demonstramos um método para realizar a transdução de vetores lentivirais shRNA para obter linhagens celulares knockdown estáveis em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs).

Nocaute de gene mediado por RNA de grampo curto em iHSPCs in vitro: um sistema de expressão de shRNA baseado em lentivírus em iHSPCs para knockdown de expressão gênica específica

Nós apresentamos um rato fetal sistema de cultura in vitro de eritroblastos fígado que disseca os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Este sistema facilita a análise funcional de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento.

Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

A manipulação da expressão gênica temporal na diferenciação de células-tronco embrionárias (ESCs) pode ser alcançada usando sistemas gênicos induzíveis. No entanto, a geração dessas linhagens celulares é cara e demorada. Este protocolo alcança a expressão rápida de um transgene na diferenciação de células derivadas de ES e subsequente análise da diferenciação hematopoiética a jusante.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.

Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

Usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI), produzimos partículas lentivirais para expressão estável de shRNAs em células-tronco embrionárias humanas H9 (hESCs) e células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs) com alta eficiência.

Entrega mediada lentiviral de shRNAs para hESCs e NPCs usando polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI)

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

Aprenda a diferenciar células-tronco hematopoéticas em eritrócitos maduros ex vivo usando vetores lentivirais para knockdown do fator de transcrição TAL1. Este método permite estudar mecanismos moleculares da eritropoiese humana.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

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