Name: Ensaio de triagem para Estresse Oxidativo em uma linhagem de células Feline astrocitária, G355-5 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a ensaiar estresse oxidativo em astrócitos felinos usando o indicador CM-H2DCFDA e citometria de fluxo. Este método quantifica espécies reativas de oxigênio para estudos de neuroproteção.

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1. Cultura de células de astrócitos felino e tratamento com H 2 O 2 <ol><li> Linha de cultura de células G355-5 em um balão de 75 cm 2 com a mídia DMEM acrescido de nutrientes, a 37 ° C e 5% de CO 2 até confluentes 60% (~ 5 dias). Substituir a mídia a cada 1-2 dias ou quando necessário para manter uma cultura saudável. </li><li> Remova a mídia e adicionar 2 ml de tripsina 0,25%. Levante as células por pipetagem por 45 s - 1 min à temperatura ambiente (RT). </li><li> Rapidamente transferir a suspensão para um tubo cônico de 15 ml contendo 10 ml de mídia. Misture delicadamente. </li><li> Centrifugar a 300 xg, 23 ° C por 3 min para obter uma pelota. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. </li><li> Adicionar ml 6-7 de mídia fresco e ressuspender as células. </li><li> Adicionar ~ 1 ml de células para cada poço de uma placa de seis poços. Adicionar 2-3 ml de mídia para cada poço e incubar até confluentes 80-90%. </li><li> Prepare uma solução 100μM de peróxido (H 2 O 2) na mídia. </li><li> Remova a mídia de cada bem e substituir com 2 ml de mídia fresco (controle), 2 ml de H 2 O 2 (tratamento) ou 2 ml de DPBS. Incubar a 37 ° CO C, 5 2% para 3 h. </li><li> Remover soluções e adicionar 1 ml de tripsina para levantar as células. Transferência de células para um tubo Eppendorf 1,7 ml contendo 0,5 ml DPBS. Esta etapa deve ser realizada em cada poço individualmente, a fim de evitar a morte celular de incubação de tripsina prolongada. </li><li> Giram a 300 xg por 3 min, descartar o. Sobrenadante e ressuspender em 1 ml de DPBS </li></ol> 2. Coloração de ROS <ol><li> Todos os passos para a coloração deve ser realizada com a exposição à luz mínima para prevenir branqueamento. </li><li> Adicionar 1 ml de 50 mM CCCP ao controle positivo. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2 por 5 min. </li><li> Adicionar 5 mL de uma solução de 10 mM CM-H DCFDA 2 à H 2 O 2 grupo. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2 por 15-30 min. Sem mancha é adicionado à amostra salina. </li><li> Lavar as amostras com 2 ml de DPBS para remover mancha residual. </li><li> Giram a 300 xg por 3 min para obter uma pelota. </li><li> Ressuspender as células em 0,5 ml de DPBS. Adicionar 1 mL PI para cada amostra, com exceção do soro fisiológico. </li><li> Transferência de amostras para um tubo de 5ml de fluxo citómetro. </li><li> Executar no citômetro de fluxo. </li></ol> 3. Citometria de fluxo <ol><li> Executar amostras em um Beckman Coulter FC500 (ou equivalente) equipado com um laser de argônio 488 nm ea banda passa a seguir: 525, 775 e 620 nm, todas ± 20 nm. </li><li> Prepare os controles apropriados: não coloridas, CM-H 2 DCFDA manchada apenas, PI só, manchado dupla (controle negativo). </li><li> Faça um protocolo que tem o histoplots seguinte: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Ele também deve ter os histogramas seguintes: número de células versus FL1, FL2 e FL3, o que corresponde às manchas. </li><li> Antes de executar as amostras, verificar o equipamento, fluidos e recipiente de resíduos. Aquecer o equipamento para, pelo menos, 20 min. </li><li> Limpar o equipamento e realizar uma calibração com as contas apropriadas de acordo com os padrões dos fabricantes. </li><li> Selecione seu protocolo e executar os exemplos. </li><li> Limpar o equipamento, como feito anteriormente. </li><li> Limpar a linha de vácuo acordo com as normas dos fabricantes. </li><li> Desligue o fluxo e limpar a linha da cabeça / vácuo. </li><li> Desligue o software eo computador. </li></ol> 4. Resultados representativos: Resultados de citometria de fluxo foram analisados ​​utilizando programa FlowJo 7,6 e os controles mancha foram usados ​​para objetivamente definir o gating. Com base nisso, as células saudáveis ​​aparecem à esquerda do histograma e ROS (estresse oxidativo) foi detectado como uma mudança de células para a direita. A Figura 1 mostra os resultados do efeito do peróxido de hidrogênio em astrócitos saudáveis ​​felino. Dados de FL1 foi usado para medir a intensidade da DCFDA 2 CM-H, que indica a presença de ROS. Como esperado, uma maior quantidade de ROS foi detectado na amostra tratada com H 2 O 2. Isso é exibido no histograma como uma mudança na intensidade de fluorescência da esquerda para a direita. Ao comparar as células saudáveis ​​tratados com DMEM versus DPBS, não houve mudança significativa na quantidade de ROS (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxo de resultados de citometria de níveis de estresse oxidativo em astrócitos saudáveis ​​felina eo efeito do H 2 O 2 em células saudáveis. Os resultados indicam que H 2 O 2 aumenta os níveis de ROS em células saudáveis, em comparação com as células sem tratamento (DMEM). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluxo Citometria de resultados de níveis de ROS detectado em células saudáveis ​​incubados por 3 horas com DPBS.

<ol><li>Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nitric+oxide+synthase+activity+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+monocytes%3A+implications+for+HIV-associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease.</a> J Exp Med. 181, 735-745 (1995).</li>
<li>Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+oxygen-based+radicals+in+methamphetamine-induced+neurotoxicity%3A+evidence+from+the+use+of+CuZnSOD+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice.</a> Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).</li>
<li>Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+picomole+levels+of+hydroperoxides+using+a+fluorescent+dichlorofluorescein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay.</a> Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).</li>
<li>Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia%3A+the+not+so+innocent+bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Glia: the not so innocent bystanders.</a> J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).</li>
<li>Cooper, A. J., Kristal, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+glutathione+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of glutathione in the central nervous system.</a> Biol Chem. 378, 793-802 (1997).</li>
<li>Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+neurotoxicity+involves+vacuolation+of+endocytic+organelles+and+dopamine-dependent+intracellular+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress.</a> J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).</li>
<li>Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+coat+protein+neurotoxicity+mediated+by+nitric+oxide+in+primary+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).</li>
<li>Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+protect+neurons+from+hydrogen+peroxide+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity.</a> J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).</li>
<li>Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Today%22%5BJournal%5D)">Neuropathogenesis of AIDS.</a> Mol Med Today. 2, 16-23 (1996).</li>
<li>Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+functions+of+glutathione+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Metabolism and functions of glutathione in brain.</a> Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).</li>
<li>Dringen, R., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+restoration+as+indicator+for+cellular+metabolism+of+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells.</a> Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).</li>
<li>Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+the+Antioxidant+Glutathione+in+Neurons%3A+Supply+by+Astrocytes+of+CysGly+as+Precursor+for+Neuronal+Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione.</a> J Neurosci. 19, 562-569 (1999).</li>
<li>Everall, I. P. H. udson, L, R. W. K. erwin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+absolute+levels+of+ascorbic+acid+and+unaltered+vasoactive+intestinal+polypeptide+receptor+binding+in+the+frontal+cortex+in+acquired+immunodeficiency+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome.</a> Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).</li>
<li>Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+nitric+oxide+generation+in+mammalian+neurons+using+dichlorofluorescin+diacetate+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).</li>
<li>Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+system+for+HIV-1-induced+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">An experimental model system for HIV-1-induced brain injury.</a> Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).</li>
<li>Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxicity+of+peptide+analogues+of+the+transactivating+protein+tat+from+Maedi-Visna+virus+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus.</a> Neuroscience. 53, 1-6 (1993).</li>
<li>Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine-induced+serotonin+neurotoxicity+is+mediated+by+superoxide+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals.</a> Brain Res. , 677-6345 (1995).</li>
<li>Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+1+envelope+proteins+induce+interleukin+1%2C+tumor+necrosis+factor+alpha%2C+and+nitric+oxide+in+glial+cultures+derived+from+fetal%2C+neonatal%2C+and+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain.</a> J Exp Med. 182, 941-951 (1995).</li>
<li>Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+HIV-1+envelope+protein+gp120+on+the+production+of+nitric+oxide+and+proinflammatory+cytokines+in+mixed+glial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures.</a> Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).</li>
<li>Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glutathione+and+cell+toxicity+following+exposure+to+neurotropic+substances+and+human+immunodeficiency+virus-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro.</a> J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).</li>
<li>Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+neuronal+cell+injury+and+death+in+AIDS+dementia+and+focal+cerebral+ischemia%3A+potential+treatment+with+NMDA+open-channel+blockers+and+nitric+oxide-related+species%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species.</a> Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).</li>
<li>Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+current+models+of+HIV-related+neuronal+injury%3A+platelet-activating+factor%2C+arachidonic+acid+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide.</a> Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).</li>
<li>Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+treatment+prevents+the+increase+in+superoxide+produced+by+epidermal+growth+factor+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells.</a> J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).</li>
<li>Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+glutathione+redox+state+in+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes.</a> Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).</li>
<li>Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C7-Dihydrodichlorofluorescein+diacetate+as+a+fluorescent+marker+for+peroxynitrite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation.</a> FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).</li>
<li>Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+efflux+from+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione efflux from cultured astrocytes.</a> J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).</li>
<li>Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+gp120+associated+neurological+deficits%3A+a+potential+role+for+nitric+oxide+and+other+signal+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules.</a> Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).</li>
<li>Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+generation+of+H2O2+for+platelet-derived+growth+factor+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction.</a> Science. 270, 296-299 (1995).</li>
<li>Wang, X. F., Cynader, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+provide+cysteine+to+neurons+by+releasing+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione.</a> J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).</li>
<li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+defense+of+the+brain%3A+a+role+for+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).</li>
<li>Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+cytometric+analysis+of+FIV-induced+injury+in+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia.</a> Glia. 13, 92-100 (1995).</li>
</ol>

Um mecanismo muitas vezes sugerido de vírus danos induzidos neuronal é o estresse oxidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Basicamente, propõe-se que através da exposição viral da glia (astrócitos e microglia) liberação de radicais de oxigênio reativo, tais como, hidróxido, ânion superóxido, óxido nítrico, e / ou peróxido de hidrogênio, que são tóxicos para os neurônios. Da mesma forma, o estresse oxidativo também tem sido sugerido como um mecanismo patológico em grandes metanfetamina neurotoxicidade ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitaminas </td><td> Cellgro </td><td> 25-020-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Hyclone </td><td> 17-605E </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Não Aminoácidos Essenciais </td><td> Hyclone </td><td> 25-025-cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 20% (v / v) </td></tr><tr><td> Aminoácidos Essenciais </td><td> Cellgro </td><td> 25-030-cl </td><td> 0,2% (v / v) </td></tr><tr><td> Sistema de filtragem a vácuo 500ml </td><td> VWR </td><td> 87006-076 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cônicos </td><td> Falcão </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 75 centímetros de cultura de tecidos 2 frascos </td><td> Falcão </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> 6 placa de cultura de tecido bem </td><td> Falcão </td><td> 353224 </td><td></td></tr><tr><td> CM-H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C6827 </td><td></td></tr><tr><td> Iodeto de propídio (PI) </td><td> Sigma </td><td> P4170-10mg </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Lonza </td><td> 17-160F </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O 2 </td><td> Sigma </td><td> H6520 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico HyQ </td><td> Hyclone </td><td> SV30079.01 </td><td> 0,1% (v / v) </td></tr><tr><td> G355-5 células </td><td> ATCC </td><td> CRL-2033 </td><td> Cérebro felino normal </td></tr></tbody></table>

ensaio de triagem para estresse oxidativo em uma linhagem de células feline astrocitária, g355-5

Screening Assay for Oxidative Stress in a Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

Um mecanismo muitas vezes sugerido de vírus danos induzidos neuronal é o estresse oxidativo. Astrócitos têm um papel importante no controle do estresse oxidativo do Sistema Nervoso Central (SNC). Astrócitos ajudar a manter um ambiente homeostático para os neurônios, assim como proteger os neurônios de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS). CM-H2DCFDA é um indicador de células-permeável para a presença de ROS. CM-H 2 DCFDA entra na célula como um composto não-fluorescente, e se torna fluorescente após esterases celulares remover os grupos acetato, eo composto é oxidado. O número de células, medido por citometria de fluxo, que são encontrados para ser fluorescentes verde é uma indicação do número de células que estão em um estado oxidativo. CM-H 2 DCFDA é suscetível à oxidação por um grande número de ROS diferente. Esta falta de especificidade, considerando que ROS pode oxidar CM-H 2 DCFDA, faz deste composto um regente valiosa para uso nas fases iniciais de uma investigação patogênese, como este teste pode ser usado para a tela para um ambiente oxidativo celular, independentemente do que o oxigênio radical ou combinação de ROS são responsáveis ​​pelas condições celular. Uma vez que foi estabelecido que ROS estão presentes por oxidação de DCFDA 2 CM-H, em seguida, experimentos adicionais podem ser realizados para determinar qual ROS ou combinação de EROs estão envolvidas no processo de patogênese particular. Os resultados deste estudo demonstram que com a adição de peróxido de hidrogênio em um aumento DCFDA 2 CM-H fluorescência foi detectada em relação aos controles salina, indicando que este teste é um teste útil para a detecção de um ambiente oxidativo dentro G355-5 células, uma linhagem celular felina astrócitos.

Um método de triagem para detectar ambientes oxidativo celular é medir a oxidação do CM-H2DCFDA. Uma vez oxidada dentro de uma célula, CM-H2DCFDA muda de não-fluorescentes em um composto fluorescente. Esta mudança de fluorescência é medida por citometria de fluxo e indica o número de células em um ambiente oxidativo.

Ensaio de triagem para Estresse Oxidativo em uma linhagem de células Feline astrocitária, G355-5

Um mecanismo frequentemente sugerido para o dano neuronal induzido por vírus é o estresse oxidativo. Os astrócitos desempenham um papel importante no controle do estresse oxidativo de...

Os astrócitos desempenham um papel importante no controle do estresse oxidativo do sistema nervoso central, ajudando a manter um ambiente homeostático para os neurônios, além de proteger os neurônios das espécies reativas de oxigênio. Aqui é apresentado um método para avaliar o estresse oxidativo em astrócitos. Para ilustrar como este ensaio funciona, o peróxido de hidrogênio e as ERO normalmente produzidas durante o metabolismo celular são aplicados a astrócitos felinos ao lado do ensaio.Para espécies reativas de oxigênio, o indicador permeável à célula CMH 2D CFDA é adicionado às células. O CMH 2D CFDA entra na célula como um composto não fluorescente, onde as esterases celulares removem os grupos acetato. Se estiverem presentes espécies reativas de oxigênio, o composto é oxidado e torna-se fluorescente.As células são então colhidas e a fluorescência é analisada por citometria de fluxo. O número de células fluorescentes indica a quantidade de células que se encontram em estado oxidativo. O objetivo, é claro, é identificar quais radicais livres de oxigênio específicos estão presentes nas células, utilizando diferentes abordagens.Isso é particularmente muito importante em neurologi

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Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve a técnica de visualização do estresse oxidativo em organoides cultivados. Este trabalho ajuda a entender o nível de estresse oxidativo devido ao acúmulo de ROS nos vários tipos celulares presentes em um organoide após o tratamento com diferentes moduladores de ROS.

Ensaio de imagem por sonda fluorescente: uma técnica para visualizar o estresse oxidativo nas células organoides intestinais cultivadas tratadas com indutor de espécies reativas de oxigênio

Este vídeo demonstra a avaliação da saúde mitocondrial em astrócitos geneticamente modificados, que expressam uma proteína fluorescente dentro de suas mitocôndrias. A proteína ajuda a rastrear mudanças na saúde mitocondrial à medida que sua fluorescência muda de verde para vermelho, indicando estresse ou dano. As imagens são capturadas e analisadas usando vários parâmetros.

Monitoramento baseado em fluorescência do estresse mitocondrial em astrócitos

Acidente vascular cerebral isquêmico é um evento complexo, no qual a contribuição específica dos astrócitos à região afetada do cérebro exposto a privação de oxigênio glicose (OGH) é difícil de estudar. Este artigo apresenta uma metodologia para obter isolados astrócitos e estudar sua reatividade e proliferação em condições OGH.

Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas

Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

Apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e uso de um modelo de estresse oxidativo, tratando células epiteliais de pigmento da retina com H2O2, analisando morfologia celular, viabilidade, densidade, glutationa e nível UCP-2. É um modelo útil para investigar o efeito antioxidante de proteínas secretadas por células transfeminadas transposon para tratar a degeneração neuroretinal.

Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida

Com base em experimentos in vitro , este estudo revelou o mecanismo da crocetina na reparação do dano por estresse oxidativo de cardiomiócitos influenciando a mitofagia, na qual a via de sinalização PINK1/Parkin desempenha um papel importante.

Proteção de Células Miocárdicas H9c2 contra o Estresse Oxidativo por Crocetina via Mitofagia Mediada pela Via PINK1/Parkin

Este protocolo descreve um novo método para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares usando diidroetídio (DHE) como sonda de fluorescência usando uma abordagem de triagem de alto rendimento. O protocolo descreve os métodos para avaliação quantitativa das espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares nas três diferentes linhagens celulares de carcinoma hepatocelular.

Avaliação de triagem de alto rendimento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando corante de fluorescência Dihidroetídio (DHE)

A quantificação das formas oxidada e reduzida de glutationa (GSSG e GSH, respectivamente) foi obtida através do uso de orto-ftalaldeído (OPA). O OPA torna-se altamente fluorescente uma vez conjugado ao GSH, mas é incapaz de conjugar o GSSG até que seja reduzido. Aqui, descrevemos um ensaio multiparamétrico para quantificar ambos usando quantificação de proteínas para normalização.

Quantificação rápida de formas oxidadas e reduzidas de glutationa usando orto-ftalaldeído em células de mamíferos cultivadas in vitro

Aqui descrevemos um protocolo que facilita a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em astrócitos funcionais específicos do prosencéfalo. Isso permite investigações sobre o papel das células gliais na patogênese de distúrbios do neurodesenvolvimento, como a Síndrome do X Frágil, e modelagem de outros distúrbios cerebrais.

Geração e caracterização de astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos sem ribonucleoproteína mensageira X frágil

Este protocolo de vídeo demonstra um novo método para a geração e subsequente purificação de células progenitoras neuronais a partir de uma fonte renovável de células estaminais neurais (NSCs) com base na sua (granulosidade tamanho e interno) física e propriedades fluorescentes usando tecnologia de citometria de fluxo.

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Aprenda a ensaiar estresse oxidativo em astrócitos felinos usando o indicador CM-H2DCFDA e citometria de fluxo. Este método quantifica espécies reativas de oxigênio para estudos de neuroproteção.

Ensaio de triagem para Estresse Oxidativo em uma linhagem de células Feline astrocitária, G355-5

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