Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

O objetivo geral do experimento a seguir é usar coleções de micróbios com código de barras em todo o genoma para entender as interações entre drogas gênicas e ambiente genético de maneira altamente paralela. Isso é conseguido rastreando a coleta de micróbios por cinco a 20 gerações de crescimento na presença de um medicamento usando robótica para manter as células em crescimento exponencial. Como segunda etapa, são coletadas células, o que nos permite extrair DNA genômico de 4.000 a 6.000 indivíduos simultaneamente.

Em seguida, os produtos de PCR que compreendem os códigos de barras amplificados são quantificados usando hibridização de microarray ou sequenciamento de código de barras para quantificar os códigos de barras e, assim, determinar a abundância de cada cepa em um pool complexo. Em última análise, são obtidos resultados que mostram quais mutantes com código de barras são sensíveis a tratamentos e, portanto, estão sendo esgotados do pool durante o curso do experimento. A principal vantagem da técnica que veremos hoje é que, em vez de lidar com cepas individualmente como colônias em placas ou uma cultura líquida individual aqui, podemos puxar dezenas ou centenas de milhares de cepas diferentes e analisá-las como um único pool.

Então, uma vez que percebemos o poder desse ensaio, precisávamos automatizá-lo e, felizmente, eu estava trabalhando no sensor Stanford Genome Technology e estava cercado de engenheiros que me permitiram fazer isso, Demonstrando o protocolo hoje estará Andrew Smith, um estudante de pós-graduação sênior em meu laboratório que percorrerá todos os protocolos e procedimentos associados, bem como Tanya Durick, que nos mostrará como fazer os aspectos de sequenciamento do protocolo. Este protocolo utiliza uma biblioteca de mutantes albicans do Canadá gerados pela transposição na mutagênese, onde cada mutante carrega uma etiqueta de código de barras para combinar mutantes individuais em um único pool. Uma cópia da biblioteca é replicada em 3 84.

Placas de poços contendo edia crescem as colônias a 30 graus Celsius por dois a três dias até atingirem o tamanho máximo. Em seguida, trabalhando em um ambiente microbiológico com chama e LabWare estéril, inunde cada bandeja com cinco a 10 mililitros de mídia e deixe de molho por cinco minutos. Resus, suspenda as colônias com um espalhador de células e despeje o líquido mais células em um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros.

Adicione DMSO a 7% Ajuste as células para uma concentração final de OD 600 de 50 por mililitro com meios contendo 7% de DMSO e, em seguida, alíquotas e volumes de 40 microlitros em tubos de tiras de PCR, alíquotas de células agrupadas podem ser armazenadas indefinidamente a menos 80 graus Celsius. Para iniciar este procedimento, descongele as alíquotas de células agrupadas no gelo, dilua imediatamente a piscina suavemente em meio com um medicamento ou condição de escolha, inoculando a um OD 600 de 0,0625 em um volume total de 700 microlitros por poço em uma placa de 48 poços. Para os fins deste vídeo, serão preparados triplicados de duas condições.

Incluir pelo menos um controlo de solvente adequado na placa. Sele a placa com um selo de placa de plástico, cultive as células em um espectrofotômetro ou um agitador com temperatura controlada agitando a 30 graus Celsius com um regime de agitação determinado experimentalmente. Por exemplo, agite por 14 minutos, leia poços por um minuto e retome a agitação.

Parte da suspensão da célula pode ser colhida pelo robô e salva em uma placa de carvão no convés robótico. Em pontos de tempo de geração definidos pelo usuário, normalmente 5, 10, 15 e 20 gerações de crescimento. Colha pelo menos dois od 600 de células para cada amostra e ponto de tempo.

Transfira as amostras de células colhidas para tubos de microcentrífuga de bloqueio seguro. Essas células podem então ser usadas para extração de DNA genômico, que será mostrado a seguir para iniciar este procedimento. DNA genômico purificado de células colhidas em vários momentos com um kit de estrela de levedura.

De acordo com as instruções do fabricante com um modificação elui, o DNA com 300 microlitros de 0,1 XTE. Em seguida, configure duas reações de PCR para cada amostra. Um para as tags UPT e outro para as tags down.

Verifique os produtos de PCR resultantes em um gel. Um produto de 60 pares de bases para ambos os PCRs é esperado para amplicons, usados para hibridização, conforme mostrado nas pistas um e três. Neste exemplo, um produto de 130 pares de bases é esperado para amplicons para sequenciamento de código de barras, conforme mostrado nas pistas cinco e sete.

Neste ponto, os produtos de PCR podem ser usados para análise de microarray ou sequenciamento direto de código de barras, dependendo de qual produto de PCR foi gerado. Para se preparar para a análise de microarray, pré-aqueça a temperatura do forno de hibridização a 42 graus Celsius e configure um banho-maria fervente e um balde de gelo contendo uma pasta de água gelada. Pré-molhe as matrizes enchendo lentamente com 120 microlitros de hibridização de um x. Buffer.

Incube as matrizes no tampão de hibridização a 42 graus Celsius e 20 RPM por 10 minutos enquanto as matrizes estão incubando, prepare tubos superiores de 0,5 mililitro com 120 microlitros de hibridização. Misture por amostra mais um extra como tampão para cada tubo. Adicione 30 microlitros de absorção, PCR e 30 microlitros de PCR down tag à mistura de hibridização para um volume total de 150 microlitros.

Ferva por dois minutos e coloque em água gelada por pelo menos dois minutos. Gire brevemente os tubos antes de usar. Remova o tampão de pré-hibridização das matrizes e adicione 120 microlitros de mistura de PCR de hibridização para evitar a evaporação.

Cubra as juntas da matriz com um ponto duro, hibridize por 16 horas a 42 graus Celsius e 20 RPM. Remova as matrizes do forno de hibridização e remova os pontos difíceis dos cavacos. Remova lentamente a mistura de hibridização das matrizes com pipeta e preencha as matrizes.

Com 120 microlitros de lavagem, uma carga das matrizes na lavadora da estação fluídica preparada. As matrizes serão lavadas utilizando o protocolo do gene Flex SV 3 4 50 com as seguintes modificações. Uma etapa extra com a lavagem A antes da coloração.

Lavagem B, temperatura de 42 graus Celsius em vez de 40 graus Celsius e coloração a 42 graus Celsius na estação fluídica em vez de 25 graus Celsius. Após as operações de fluidos, execute a estação fluídica, desligue quatro protocolos 50. Descarregue a lavadora depois de garantir que não haja bolhas de ar.

Coloque as matrizes no scanner e digitalize em um comprimento de onda de emissão de 560 nanômetros. O produto de PCR de 130 pares de bases é usado para sequenciamento de código de barras de próxima geração para realizar essas primeiras amostras separadas de DNA de 12 pools em um gel de 12% de páginas. Em seguida, pinte o gel com verde cibernético e corte a faixa de gel de interesse.

O DNA extraído do gel é então quantificado por PCR em tempo real para gerar clusters em uma única célula de fluxo de leitura usando a CBOT e o kit de geração de cluster de leitura única. Carregue a célula de fluxo no sequenciador e observe a primeira base saindo. O sequenciador mostrado aqui é uma matriz representativa Dados coletados em determinados pontos do protocolo.

O pool de mutantes marcados foi cultivado por 20 gerações na presença do agente antifúngico clotrimazol e no DMSO como um log de controle, duas proporções foram calculadas e plotadas para cada gene. Todas as cepas que são significativamente sensíveis ao tratamento com clotrimazol com uma proporção de log dois de dois são destacadas em vermelho. Quatro cepas são mostradas neste exemplo, NCP, um ERG dois e dois alelos independentes de ERG 11.

O alvo proteico conhecido das cepas de clotrimazol do medicamento antifúngico detectadas como sensíveis em uma triagem agrupada deve ser verificado quanto à sua sensibilidade em ensaios de crescimento individual na presença da mesma concentração do medicamento. Este próximo gráfico mostra os resultados de um experimento de confirmação aqui. As quatro cepas detectadas na tela tiveram crescimento diminuído em relação à cepa parental do tipo selvagem.

BWP 17 indicado em preto. Essas curvas de crescimento individual destacam uma característica importante de tais triagens de drogas genéticas agrupadas, que é que a classificação absoluta de uma cepa específica não reflete necessariamente seu nível exato de sensibilidade. Além disso, os resultados mostram o valor de ter vários alelos para cada gene.

Nesse caso, os dois mutantes de interrupção do ERG 11 têm sensibilidades ligeiramente diferentes à droga. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco dias, desde a inoculação da tela até a análise dos dados, se executada corretamente. Portanto, embora cada experimento individual seja biologicamente revelador, o verdadeiro poder vem quando você faz muitos experimentos e coleta um banco de dados de modo que agora é capaz de prever a função do gene e a ação da droga.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar coleções mutantes com código de barras em todo o genoma para triagem de pool e também como usar microray ou sequenciamento para identificar genes de interesse após seu desenvolvimento. Essa técnica permitiu que pesquisadores no campo da genômica funcional explorassem a função de cada um dos 6.000 genes diferentes no genoma da levedura.