Name: Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Aprenda a realizar telas genômicas competitivas usando coleções de microrganismos com códigos de barras para identificar interações gene-droga em Candida albicans. Este método automatizado permite analisar milhares de mutantes simultaneamente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Ron Davis, Adam Deutschbauer, eo laboratório HOP toda HIP da Universidade de Toronto para discussões e aconselhamento. CN é suportado por concessões do National Human Genome Research Institute (Grant Número HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, e Canadian Cancer Society (# 020380). JO foi apoiado pelo Programa de Formação de Stanford Genome (Grant Número T32 HG00044 do National Human Genome Research Institute) e os Institutos Nacionais de Saúde (Grant Número GH000205 P01). GG é suportado pelo RO1 NHGRI HG003317 e da Sociedade Canadense do Câncer, Grant # 020380, TD e do Centro de Seqüenciamento Donnelly é suportado, em parte por doações da Fundação Canadense para Inovação, para as Dras. Brenda e Jack Andrews Greenblatt. AMS é apoiado por uma Universidade de Toronto Fellowship Open.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, esboçamos um protocolo que, com a alteração modesta, pode ser facilmente adaptado a uma ampla gama de colecções existentes de código de barras coleções mutantes de microorganismos diferentes para criar coleções tag mutantes. Ressaltamos que, embora tenhamos relatado um protocolo sobre a mutagênese transposon marcadas para a levedura patogênica C. albicans, um protocolo muito semelhante poderia ser adaptado a uma grande variedade de fungos unicelulares. Modificada, este protocolo funciona bem em bactérias 13 e, atualmente, coleções para um número adicional de genomas de fungos e bactérias estão em construção. Atualmente, este ensaio fornece a única abrangente, a tela do genoma imparcial para interações gene-pequena molécula. Um aspecto particularmente atraente do ensaio é que nenhum conhecimento prévio do gene ou molécula pequena é necessária. Apesar do alcance e do poder destes ensaios, a sua transferência para outros laboratórios tem sido dificultada pelo pouco investimento de capital inicial e as ferramentas de informática para a análise dos resultados. Com a adoção de uma leitura próxima geração seqüência combinada com ferramentas robustas para análise, esperamos a sua aprovação a aumentar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibióticos </td><td> Número de fornecedores e catálogo </td></tr><tr><td> Carbenicilina </td><td> Sigma, parte # C1613 </td></tr><tr><td> Canamicina </td><td> Sigma, parte # K1876 </td></tr><tr><td> espectinomicina </td><td> Sigma, parte # S0692 </td></tr><tr><td> Cloranfenicol </td><td> Sigma, parte # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Clean-up e kits de concentração </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep rotação Miniprep Kit </td><td> Qiagen, parte # 27106 </td></tr><tr><td> Kit Maxi HiSpeed ​​Plasmid </td><td> Qiagen, parte # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick Kit de Purificação PCR </td><td> Qiagen, parte # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, parte # 28704 </td></tr><tr><td> PCR e reagentes eletroforese </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase (Mg-free) do buffer </td><td> New England Biolabs, parte # M0320L </td></tr><tr><td> Mix Solução desoxinucleotídeo </td><td> New England Biolabs, parte # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, parte # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose, corante e ácido nucléico mancha adequado para eletroforese em gel </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Tampão TAE 10X </td><td> Sigma, parte # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb DNA Ladder Mais </td><td> Invitrogen, parte # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD caldo </td><td></td></tr><tr><td> 10 g de extrato de levedura </td><td> Sigma, parte # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g de peptona Bacto </td><td> BD Biosciences, parte # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g de dextrose </td><td> Sigma, parte # D9434 </td></tr><tr><td> Material de laboratório </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas multicanal (1000, 200 e 20 mL) </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Descartáveis ​​reservatórios pipetagem </td><td> Vários </td></tr><tr><td> 15 e 50 mL tubos de centrífuga </td><td> Vários </td></tr><tr><td> 96 - e 384-poço profundo Placas Bem </td><td> Axygen Scientific, parte # P-2ML-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> De 96 poços e 384 placas de bem-PCR e filme de vedação </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Rolo de chapa para a selagem de poços múltiplos placas </td><td> Sigma, parte # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C e 37 ° C agitando incubadoras para o crescimento de bactérias e leveduras em placas e em tubos </td><td> Vários </td></tr><tr><td> In vitro transposon mutagênese </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 transposase </td><td> Biotecnologias Epicentro, parte # TNP92110 </td></tr><tr><td> Alto rendimento de transformação </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Kit Prep Plasmid </td><td> Borda Biosystems, parte # 84359 </td></tr><tr><td> polietileno glicol, peso molecular 3350 </td><td> Vários </td></tr><tr><td> acetato de lítio </td><td> Sigma, parte # 517992 </td></tr><tr><td> 6-bem pratos, estéril </td><td> Corning, parte # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / mL uridina </td><td> Sigma, parte # U3750 </td></tr><tr><td> 100X solução tampão Tris-EDTA </td><td> Sigma, parte # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Vários </td></tr><tr><td> salmão testículo DNA </td><td> Sigma, parte # 1626 </td></tr><tr><td> Crescimento das coleções de código de barras </td><td></td></tr><tr><td> 48 placas bem, se crescer culturas em placas </td><td> Greiner, parte # M9437 </td></tr><tr><td> Colantes placa </td><td> ABgene, parte # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 frascos de cultura mL </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro capaz de absorbância </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Temperatura controlada shaker para balões de 250 ml ou espectrofotômetro agitação </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Seguro-Lock tubo de microcentrífuga, 2 mL </td><td> Eppendorf, parte # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Equipamentos de hibridização </td><td></td></tr><tr><td> Forno de hibridização 640 </td><td> Affymetrix, parte # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip Fluidic Station 450 </td><td> Affymetrix, parte # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, parte # 00-0212 </td></tr><tr><td> Banho de água fervente com suporte flutuante </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Consumíveis de hibridização </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag Matriz 16K v2 </td><td> AffymEtrix, parte # 511331 </td></tr><tr><td> Solução Denhardt, a concentrar-50X </td><td> Sigma, parte # D2532 </td></tr><tr><td> Estreptavidina, R-ficoeritrina conjugada (SAPE) </td><td> Invitrogen, parte # S866 </td></tr><tr><td> Seguro-Lock tubo de microcentrífuga de 0,5 mL </td><td> Eppendorf, parte # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversified Biotech, parte # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, parte # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, parte # T2700 </td></tr><tr><td> MES monohidrato do ácido livre </td><td> Sigma, parte # M5287 </td></tr><tr><td> MES sal de sódio </td><td> Sigma, parte # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, parte # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, parte # S2015 </td></tr><tr><td> Água de grau de biologia molecular </td><td> Sigma, parte # W4502 </td></tr><tr><td> Primers hibridação </td><td> Diversos fornecedores (dessalinização standard) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> &quot;GATGTCCACGAGGTCTCT 3 &#39;5 </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotina-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotina-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotina-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Seqüenciamento Primers: Plataforma Illumina </td><td> Diversos fornecedores </td></tr><tr><td> UpTag Forward (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GGC GAC GAA GCA ATA CGA GCT CTT ATC CCG T GAT GTC GTC GAG CAC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;GAT AAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT ATC CCG T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Forward (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GGC GAC GAA GCA ATA CGA GCT CTT ATC CCG T GAA GAG AAC CTC TTC GAA ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;GAT AAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT ATC CCG T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Leia um UP-tag cartilha seq (100um) </td><td> 5 &#39;GAC GTC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leia um BAIXO tag-primário seq (100um) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Ler 2 cartilha Seqüenciamento Index (padrão primário Illumina R1) (100um) </td><td> 5 &#39;ACT AC CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT ATC CCG T 3&#39; </td></tr><tr><td> Reagentes adicionais Seqüenciamento / Equipamentos </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF Kit de purificação de PCR </td><td> Qiagen, parte # 29051 </td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Qualquer fornecedor </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Manifold Vacuum </td><td> Macherey-Nagel, parte # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, parte # Q32853 </td></tr><tr><td> Ensaio Invitrogen tubos Qubit </td><td> Invitrogen, parte # Q32856 </td></tr><tr><td> 40 acrilamida% mais 1% N, N&#39;-metileno-bis-acrilamida, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, parte # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base de Dados </td><td> Sigma, parte # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Sigma, parte # B6768-500G </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Teknova, parte # E0306 </td></tr><tr><td> Persulfato de amônio </td><td> Sigma, parte # A3678-25G </td></tr><tr><td> Temed </td><td> Bioshop, parte # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Solução de brometo de etídio </td><td> Bioshop, parte # ETB444.10 </td></tr><tr><td> Acetato de amônio 0,5 M </td><td> Teknova, parte # A2000 </td></tr><tr><td> Tetra acetato de magnésio 10mM </td><td> Sigma, parte # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Ver EDTA 0.5M, pH 8.0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Acetato de sódio, pH 5,2 </td><td> Teknova, parte # S0297 </td></tr><tr><td> Vácuo velocidade </td><td> Vários </td></tr><tr><td> Leia Kit Single-Generation Cluster </td><td> Illumina, parte # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Seqüenciamento Kit v4 </td><td>Illumina, parte # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> Receita TBE 10X <table border="1"><tbody><tr><td> Quantidades </td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> 108 gramas </td><td> Tris Base de Dados </td></tr><tr><td> 55 gramas </td><td> Ácido bórico </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> EDTA 0,5 M (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar dH 2 O para 1L marca </td></tr></tbody></table> 12% da receita em gel de poliacrilamida <table border="1"><tbody><tr><td> Volumes </td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40 acrilamida% mais 1% N, N&#39;-metileno-bis-acrilamida, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> TBE 10X </td></tr><tr><td> 140 mL </td><td> Persulfato de amônio 10% </td></tr><tr><td> Volume total: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag mistura de iniciadores: Ressuspender Uptag e Buptagkanmx4 cada um em DDH 2 O a 100 mM, em seguida, misture em uma proporção de 1:1 para uma concentração final de 50 mM cada um. Armazenar a -20 ° C. Downtag mistura de iniciadores: Ressuspender Dntag e Bdntagkanmx4 cada um em DDH 2 O a 100 mM, em seguida, misture em uma proporção de 1:1 para uma concentração final de 50 mM cada um. Armazenar a -20 ° C. Oligonucleotides misto: Ressuspender cada um dos seguintes oito oligos (standard já dessalgado) em DDH 2 O a 100 mM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Misturar um volume igual de oito oligonucleotídeos para uma concentração final de 12,5 mM cada um. 12X de ações MES: Para 10 ml, dissolver 0,7 g MES monohidrato do ácido livre e 1,93 g de sal de sódio MES em 8 ml de água de grau de biologia molecular. Depois de misturar bem, verificar o pH e se necessário ajustar a um pH 6,5-6,7. Adicionar água a um volume total de 10 ml. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C protegido da luz (por exemplo, envolva o tubo em papel alumínio). Substituir se a solução torna-se visivelmente amarelo ou após 6 meses. 2X tampão de hibridação: Para 50 ml, misturar 8,3 ml de 12X MES estoque (de 2.9.14), 17,7 ml de 5 M NaCl, 4,0 ml de 0,5 M EDTA, 0,1 ml de 10% Tween 20 (vol / vol), e 19,9 ml filtrados DDH 2 O. Filtro de esterilizar. Lavar A: Misturar 300 ml 20X SSPE, 1 mL de Tween 10% (vol / vol), 699 ml DDH 2 O. Filtro de esterilizar. Lavar B: Misture 150 ml 20X SSPE, 1 mL de Tween 10% (vol / vol), 849 ml DDH 2 O. Filtro de esterilizar. Seqüenciamento primers de código de barras Em seqüências UP tag-primário a 5 &#39;da cauda (negrito) são seqüências de Illumina adaptador específico incorporado o primer F e R. A seqüência variável (itálico) representa a marca de indexação 5-mer usado em multiplexação / index de leitura. A cauda do 3 &#39;(sublinhado) representa o primer comum de acompanhamento do código de barras uptag e é necessário para ampliar os códigos de barras de levedura. Em Down tag-primário seqüências 5 &#39;cauda é idêntica à 5&#39; cauda de UP-tag primers (seqüência específica Illumina), no entanto, a 3 &#39;cauda (sublinhado) é substituído pelo primers comuns que são usados ​​para amplificar o DOWN- tag barcodes.

competitiva screens genomic de bibliotecas yeast barcoded

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Em virtude dos avanços em tecnologias de próxima geração de sequenciamento, temos acesso a novas seqüências do genoma quase que diariamente. O ritmo destes avanços está se acelerando, prometendo uma maior profundidade e amplitude. À luz desses avanços extraordinários, a necessidade de rápido, métodos paralelos para definir a função do gene torna-se cada vez mais importante. Coleções de mutantes do genoma exclusão em leveduras e E. coli têm servido como burros de carga para a caracterização funcional da função dos genes, mas esta abordagem não é escalável, atual gene-apagamento abordagens exigem cada um dos milhares de genes que compõem o genoma a ser excluído e verificada. Somente após esse trabalho é completo pode buscamos high-throughput fenotipagem. Durante a última década, nosso laboratório tem refinado uma carteira de competitivo, miniaturizado, do genoma de alto rendimento ensaios que podem ser executadas em paralelo. Esta paralelização é possível por causa da inclusão de &#39;tags&#39; DNA, ou &quot;código de barras,&quot; em cada mutante, com o código de barras que serve como um proxy para a mutação e pode-se medir a abundância de código de barras para avaliar aptidão mutante. Neste estudo, procuramos preencher a lacuna entre seqüência de DNA e código de barras coleções mutante. Para conseguir isso, apresentamos uma abordagem combinada transposon interrupção código de barras, que abre os ensaios de código de barras paralelas para recém seqüenciados, mas mal caracterizada micróbios. Para ilustrar esta abordagem, apresentamos uma nova Candida albicans coleção rompimento com código de barras e descrever a forma como o microarray-based e próxima geração de plataformas baseadas em seqüenciamento pode ser usado para coletar 10.000 - 1.000.000 gene-gene e gene-drogas interações em um único experimento.

Nós desenvolvemos abrangente, imparcial genome-wide telas para entender gene de drogas e interações gene-ambiente. Métodos para a triagem dessas coleções mutantes são apresentados.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

Graças aos avanços nas tecnologias de sequenciamento de nova geração, temos acesso a novas sequências genômicas quase diariamente. O ritmo desses avanços é...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar coleções de micróbios com marcadores genéticos em todo o genoma para compreender interações entre genes e drogas e entre genes e ambientes de maneira altamente paralela. Isso é alcançado por meio da triagem da coleção de micróbios durante cinco a 20 gerações de crescimento na presença de uma droga, utilizando robótica para manter as células em crescimento exponencial. Como segundo passo, as células são coletadas, o que nos permite extrair DNA genômico de 4.000 a 6.000 indivíduos simultaneamente.Os próximos produtos de PCR, compreendendo as barcodagens amplificadas, são quantificados utilizando hibridização em microarranjo ou sequenciamento de códigos de barras, a fim de quantificar os códigos de barras e, assim, determinar a abundância de cada linhagem em um pool complexo. Em última análise, obtêm-se resultados que mostram quais mutantes com códigos de barras são sensíveis aos tratamentos e, portanto, estão sendo eliminados do pool ao longo do experimento. A principal vantagem da técnica que veremos hoje é que, ao invés de lidar com linhagens individualmente como colônias em placas ou um cultivo líquido individual aqui, podemos reunir dezenas ou centenas de milhares de linhagens diferentes e analisá-las como um único pool.Assim que percebemos o poder deste ensaio, precisamos automatizá-lo, e, felizmente, eu estava trabalhando no sensor de Tecnologia Genômica de Stanford e estava cercado por engenheiros que me permitiram realizar isso. Demonstrando o protocolo hoje estará Andrew Smith, um estudante de pós-graduação sênior no meu laboratório, que percorrerá todos os protocolos e procedimentos associados, bem como Tanya Durick, que nos mostrará como realizar os aspectos de sequenciamento do protocolo. Este protocolo utiliza uma biblioteca de mutantes de Candida albicans gerados por mutagênese com transposon, na qual cada mutante carrega uma etiqueta de código de barras para combinar mutantes individuais em um único pool. Uma cópia da biblioteca é replicada em 3 84.Placas de poços contendo meio devem crescer as colônias a 30 graus Celsius por dois a três dias, até atingirem o tamanho máximo. Em seguida, trabalhando em um ambiente de microbiologia com chama e material de laboratório estéril, encha cada bandeja com cinco a 10 mililitros de meio e deixe em repouso por cinco minutos. Resuspenda as colônias com um espalhador celular e despeje o líquido com as células em um tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros.Adicione DMSO até 7%. Ajuste as células para uma concentração final de OD 600 de 50 por mililitro com meio contendo 7% de DMSO e, em seguida, alíquotas de 40 microlitros em tubos de PCR. As alíquotas de células agrupadas podem ser armazenadas indefinidamente a menos 80 graus Celsius. Para iniciar este procedimento, descongele as alíquotas de células agrupadas em gelo e, imediatamente, dilua suavemente o pool em meio com uma droga ou condição de escolha, inoculando em uma OD 600 de 0,0625 em um volume total de 700 microlitros por poço em uma placa de 48 poços. Para fins deste vídeo, serão preparadas triplicatas de duas condições.Inclua pelo menos um controle apropriado de solvente na placa. Sobreponha a placa com um selo plástico, cultive as células em um espectrofotômetro ou em um agitador controlado por temperatura a 30 graus Celsius, com um regime de agitação determinado experimentalmente. Por exemplo, agite por 14 minutos, leia as poças por um minuto e, em seguida, retome a agitação.Parte da suspensão celular pode ser colhida pelo robô e armazenada em uma placa de carvão no deck robótico. Nos pontos de tempo de geração definidos pelo usuário, tipicamente 5, 10, 15 e 20 gerações de crescimento. Colete pelo menos duas od 600 de células para cada amostra e ponto de tempo.Transfira as amostras de células colhidas para tubos de microcentrífuga com fechamento seguro. Essas células podem então ser usadas para extração de DNA genômico, o que será mostrado a seguir para iniciar este procedimento. DNA genômico purificado de células colhidas em diferentes pontos de tempo com um kit de levedura.De acordo com as instruções do fabricante, com uma modificação, elua o DNA com 300 microlitros de 0,1 XTE. Em seguida, prepare duas reações de PCR para cada amostra: uma para as sequências UPT e outra para as sequências downstream.Verifique os produtos da PCR resultantes em um gel. É esperado um produto de 60 pares de bases em ambas as PCR para os amplicons utilizados na hibridização, conforme mostrado nas linhas um e três. Neste exemplo, é esperado um produto de 130 pares de bases para os amplicons destinados ao sequenciamento de códigos de barras, conforme mostrado nas linhas cinco e sete.Neste ponto, os produtos de PCR podem ser usados tanto para análise em microarranjo quanto para sequenciamento direto de códigos de barras, dependendo de qual produto de PCR foi gerado. Para preparar a análise em microarranjo, aqueça previamente o forno de hibridização a 42 graus Celsius e prepare um banho-maria em ebulição e um balde com gelo contendo uma pasta de gelo e água. Umedeça previamente os arranjos preenchendo-os lentamente com 120 microlitros de hibridização tampão a uma vez.Incube as matrizes no tampão de hibridização a 42 graus Celsius e 20 RPM durante 10 minutos. Enquanto as matrizes estão em incubação, prepare tubos de tampa rosqueável de 0,5 mililitro com 120 microlitros de hibridização. Misture por amostra mais um adicional como tampão em cada tubo. Adicione 30 microlitros de PCR de sequência de captação e 30 microlitros de PCR de sequência de ligação descendente à mistura de hibridização, obtendo um volume total de 150 microlitros.Ferva por dois minutos e coloque em água com gelo por pelo menos dois minutos. Gire brevemente os tubos antes do uso. Remova o tampão de pré-hibridização das matrizes e adicione 120 microlitros da mistura de PCR de hibridização para prevenir evaporação.Cubra as juntas do arranjo com uma mancha resistente, hibridize por 16 horas a 42 graus Celsius e 20 RPM. Remova os arranjos do forno de hibridização e retire as manchas resistentes dos chips. Remova lentamente a mistura de hibridização dos arranjos com pipeta e preencha os arranjos.Com 120 microlitros de solução de lavagem, carregue as matrizes no lavador da estação fluidica preparada. As matrizes serão lavadas utilizando o protocolo gene Flex SV 3 4 50 com as seguintes modificações. Um passo adicional com a solução de lavagem A antes da coloração.Lave B, temperatura de 42 graus Celsius em vez de 40 graus Celsius e coloração a 42 graus Celsius na estação fluidica em vez de a 25 graus Celsius. Após as operações fluidicas, execute a estação fluidica, desligue o protocolo quatro 50. Descarregue o lavador após garantir que não haja bolhas de ar presentes.Coloque as matrizes no leitor e faça a leitura em um comprimento de onda de emissão de 560 nanômetros. O produto de PCR de 130 pares de bases é utilizado para sequenciamento de códigos de barras de próxima geração, com o objetivo de separar inicialmente 12 amostras de DNA em um gel de PAGE a 12%. Em seguida, cora o gel com verde cyber e recorte a faixa de gel de interesse.O DNA extraído do gel é então quantificado por PCR em tempo real para gerar clusters em uma flow cell de leitura simples usando o CBOT e o kit de geração de clusters de leitura simples. Carregue a flow cell no sequenciador e observe a primeira base liberada. O sequenciador mostrado aqui é uma representação do arranjo. Dados coletados em determinados pontos do protocolo.O pool de mutantes marcados foi cultivado por 20 gerações na presença do agente antifúngico clotrimazol e em DMSO como controle; a razão log dois foi calculada e representada graficamente para cada gene. Todas as cepas que são significativamente sensíveis ao tratamento com clotrimazol, com uma razão log dois igual a dois, estão destacadas em vermelho. Quatro cepas são mostradas neste exemplo: NCP um, ERG dois e dois alelos independentes de ERG 11.O alvo proteico conhecido do medicamento antifúngico clotrimazol deve ter sua sensibilidade verificada em ensaios individuais de crescimento, na presença da mesma concentração do fármaco, para as cepas identificadas como sensíveis em uma triagem em pool. Este próximo gráfico mostra os resultados de um experimento de confirmação realizado aqui. As quatro cepas detectadas na triagem apresentaram crescimento reduzido em relação à cepa parental do tipo selvagem.BWP 17 indicado em preto. Essas curvas individuais de crescimento destacam uma característica importante dessas telas genéticas com fármacos em pool, que é a de que a classificação absoluta de uma determinada linhagem não reflete necessariamente seu nível exato de sensibilidade. Além disso, os resultados mostram o valor de se ter múltiplos alelos para cada gene.Neste caso, os dois mutantes com interrupção de ERG 11 apresentam sensibilidades ligeiramente diferentes à droga. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco dias, desde a inoculação do ensaio até a análise dos dados, se realizada corretamente. Assim, embora cada experimento individual seja biologicamente revelador, o verdadeiro poder surge quando você realiza muitos experimentos e coleta uma base de dados que lhe permite prever a função gênica e a ação da droga.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar coleções genômicas de mutantes com códigos de barras para triagem em pool, bem como de como usar microrrevestimento ou sequenciamento para identificar genes de interesse após seu desenvolvimento. Esta técnica permitiu aos pesquisadores na área de genômica funcional explorar a função de cada um dos 6.000 genes diferentes no genoma da levedura.

competitive-genomic-screens-of-barcoded-yeast-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos uma tela superexpressão plasmídeo...

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

Análise Quantitativa de Fitness (QFA) é uma série complementar de métodos experimentais e computacionais para estimar as aptidões cultura microbiana. QFA estima o efeito de mutações genéticas, drogas ou outros tratamentos aplicados sobre o crescimento micróbio. Experimentos de escala a partir da análise focalizada de uma única cultura a milhares de culturas paralelas podem ser projetados.

Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas por células activadas por fluorescência em placas de agar, separa os esporos por agitação com esferas de vidro, e determina que as colónias foram dispostas aleatoriamente derivada da mesma tétrade original utilizando códigos de barras moleculares.

MELHOR: Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads

Aqui apresentamos um método econômico para definir interações químico-genéticas em leveduras em brotamento. A abordagem é construída sobre técnicas fundamentais em biologia molecular de leveduras e é adequada para o interrogatório mecanicista de pequenas e médias coleções de produtos químicos e outros ambientes de mídia.

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Apresentamos um protocolo detalhado para construir e rastrear bibliotecas mutantes para campanhas de evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae.

Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Este protocolo descreve uma metodologia de alta produtividade para a tela funcionalmente para herança à base de proteínas no S. cerevisiae.

Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Sequenciamento profundo das populações de leveduras selecionadas para interações de 2-híbrido de levedura positivos potencialmente produz uma riqueza de informações sobre interação proteínas do parceiro. Aqui, descrevemos o funcionamento das ferramentas de Bioinformática específicos e software atualizado personalizado para analisar os dados de sequência de tais telas.

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

Este artigo apresenta um método baseado em acasalamento para facilitar a triagem de superexpressão em leveduras brotamento usando uma biblioteca de matriz do plasmídeo.

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Apresentamos um protocolo de tela simples supressor em fissão fermento. Este método é eficiente, livre de mutagênico e seletiva para as mutações que ocorrem frequentemente em um único locus genômico.  O protocolo é apropriado para isolar supressores que aliviar defeitos de crescimento em cultura líquida que são causados por uma mutação ou uma droga.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

Aprenda a realizar telas genômicas competitivas usando coleções de microrganismos com códigos de barras para identificar interações gene-droga em Candida albicans. Este método automatizado permite analisar milhares de mutantes simultaneamente.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

Explorar mais vídeos