Name: Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Aprenda a dissecar e imaginar omatídeos únicos de Drosophila para estudar eventos intracelulares em modelos de neurodegeneração. Este método permite criar culturas primárias de neurônios para análise avançada.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Bernard Charroux para as discussões. Este trabalho foi financiado pela Escola KCL Biomédica.

1. Dissecção da retina Drosophila <ol><li> Preencher um poço de uma lâmina de vidro 3-Bem com tampão fosfato salina (PBS 1X), e depois anestesiar voa de CO 2. Os machos e as fêmeas podem ser utilizados para este experimento. </li><li> Uma vez que as moscas são anestesiados, pegar uma única mosca usando uma pinça e solte-o no prato pequeno de PBS. </li><li> De acordo com um escopo de dissecação, aperte a tromba com uma pinça, e depois retirar a cabeça do corpo, cortando o pescoço com um segundo conjunto de fórceps. </li><li> Segurando a cabeça voar a partir do proboscis, cortado pela metade ao longo da linha média esquerda / direita a cabeça voar com microtesoura para revelar o cérebro. </li><li> Use uma ponteira de corte para pegar a retina, e transferir para um segundo poço da lâmina de vidro 3-Bem cheio com meio Schneider. </li><li> Primeiro, descascar mais da cutícula cabeça e em seguida, retire o cérebro com uma pinça. Manter a retina colada entre a lâmina ea córnea. </li><li> Em seguida, transferir a retina em uma gota (50 ul) de médio Schnieder fresco colocado diretamente da lâmina de vidro. </li></ol> 2. Dissecção da omatídeos <ol><li> Dependendo do objetivo final da dissecção (se a imagem imediata ou cultura) e na óptica do microscópio de fluorescência (direto ou invertido), esta etapa pode ter lugar numa lâmina de microscópio ou uma placa de 24 poços. Para o objectivo final desta dissecção, a omatídeos serão dissecados diretamente sobre a lâmina de vidro. </li><li> Compreender tanto o fim mais dorsal ou ventral da retina com uma pinça. Usando microtesoura, corte a retina na metade ao longo da linha média dorsal / ventral para expor os omatídeos no meio do olho. </li><li> Continuar a se agarrar a retina de tal forma que a córnea é voltado para baixo ea lâmina é virada para cima. Usando uma agulha de tungstênio fino, retire o omatídeos da lâmina e da córnea. </li><li> Omatídeos individuais e grupos de omatídeos irá recolher no fundo do poço ou slide. Remova todos os maiores detritos que possam ter recolhido antes de prosseguir. </li></ol> 3. Coloração, tratamento e imagem <ol><li> Para analisar a autofagia, diluir 1:1000 Lyso Tracker na queda Schneider (primeiro diluir 1:10 em Schneider e adicione 0,5 mL para a queda no slide), misture e aguarde 10 segundos. </li><li> Retire o excesso de líquido a partir do slide, tendo o cuidado de deixar para trás o omatídeos. Este é o melhor feito com uma ponta fina de gel loading. </li><li> Adicionar uma gota de Vectashield para cobrir os omatídeos, cobrir com uma lamela e selar com verniz. </li></ol> 4. Resultados representativos: A boa execução do protocolo deve deixar um número de omatídeos individuais e de pequenos grupos de omatídeos mantidos juntos por fragmentos de lâmina, mas bem separada do lado da córnea. Estes podem ser visualizados como neste exemplo para visualizar Atg8: GFP e Lyso Tracker, mostrando autofagossomas, lisossomos e autophagolysosomes (Fig. 3). O método pode ser usado para geração de imagens ao vivo, no entanto, neste caso, é de notar que a autofluorescência de meio Schneider fará com que seja difícil de distinguir os sinais de baixa intensidade fluorescente. Um problema adicional é que os grânulos de pigmento que permanecer solidários com os fotorreceptores são intensamente fluorescentes, especialmente no canal vermelho. Uma imagem de campo claro pode ser necessária para distingui-las das organelas genuíno. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma do procedimento de dissecção para obter omatídeos individuais ou pequenos grupos de omatídeos da retina voar. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Variações possíveis do protocolo simples descrevem que envolvem genética da mosca e envelhecimento upstream da dissecção e coloração ou cultura para até 24 horas ea jusante de drogas de administração da dissecção. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 varredura confocal de autofagossomas e lisossomos em um único omatídeo dissecados de aw; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP:.: Atg8 / fly +, expressando uma poliglutaminas Atrophin mutante e com idades entre 12 dias a 29 ° C. O painel de campo claro (à direita) exibe a estrutura quase intacta da omatídeo eo quadro indica a área digitalizada. Os lisossomos marcas vermelhas, verdes do autofagossomas, auto-lisossomos, resultando pela fusão das duas organelas, aparecem amarelo. Das setas indicam dois eventos de fusão em curso entre autofagossomas e lisossomos.

<ol><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li>
<li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling%3A+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li>
<li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li>
<li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li>
<li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A dissecção omatídeo única apresentada aqui permite a coleta de informações mais profundas sobre os processos biológicos celulares, como neurodegeneração, quando modelada no olho Drosophila. Os neurônios fotorreceptores são mais facilmente acessível do que outros neurônios e eles citoplasma é particularmente grande, e, portanto, adequado para estudar a dinâmica da vesícula, nas células mesma usada eficientemente em muitos modelos para quantificar neurodegeneração in vivo. O aspecto crítico da dissecção...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Dispenser CO2 portáteis </td><td> Flystuff </td><td> 59-150 </td><td> Recargas também está disponível </td></tr><tr><td> DUMONT Tweezer n º 5 </td><td> AGAR Scientific </td><td> T5034 </td><td></td></tr><tr><td> 3-Bem lâmina de vidro </td><td> EMS </td><td> 71561-01 </td><td></td></tr><tr><td> Micro tesoura </td><td> VWR </td><td> HAMMHSB516-09 </td><td></td></tr><tr><td> Médio Schneider </td><td> VWR </td><td> 733-1663 </td><td></td></tr><tr><td> Lyso Tracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td><td></td></tr><tr><td> Slides Superfrost </td><td> VWR </td><td> 631-0108 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield com DAPI </td><td> Vector Labs </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> VWR </td><td> 631-1336 </td><td></td></tr></tbody></table>

Único drosophila dissection omatídeo e imagem

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

A mosca da fruta Drosophila melanogaster fez contribuições inestimáveis ​​para pesquisa em neurociência e tem sido amplamente utilizado como modelo para doenças neurodegenerativas por causa de sua genética poderosa 1. O olho da mosca em particular, tem sido o órgão de escolha para a pesquisa neurodegeneração, sendo a parte mais acessível e de vida dispensáveis ​​do sistema nervoso Drosophila. No entanto, a ressalva importante de olhos intactos é a dificuldade, por causa da intensa autofluorescência do pigmento, em eventos intracelulares de imagem, como a autofagia dinâmica 2, que são fundamentais para a compreensão da neurodegeneração. Temos utilizado recentemente a dissecção ea cultura de omatídeos única 3 que tem sido essencial para a nossa compreensão das disfunções autofágica em um modelo de voar (DRPLA) 3 de Dentatorubro-Pallidoluysian Atrofia, 4. Temos agora um relatório de descrição abrangente dessa técnica (Fig. 1), adaptado de estudos eletrofisiológicos 5, que é provável expandir dramaticamente a possibilidade de voar por modelos neurodegeneração. Este método pode ser adaptado a imagem ao vivo de eventos subcelulares e para monitorar a administração da droga eficaz para células fotorreceptoras (Fig. 2). Se usado em combinação com técnicas de mosaico 6-8, as respostas das células geneticamente diferentes podem ser testadas em paralelo (Fig. 2).

O fator limitante no uso do adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Olho para estudar neurodegeneração e biologia celular é a imagem difícil de processos intracelulares. Descrevemos a dissecação de omatídeos única para gerar uma boa-fé de cultura de células neuronais primários, que podem ser sujeitos a tratamento medicamentoso e avançados de imagem.

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster trouxe contribuições inestimáveis para a pesquisa em neurociência e tem sido amplamente utilizada como modelo para doenças neurodegenerativas...

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e obter imagens de um único drosophila ou matia para estudar eventos intracelulares em modelos de neurodegeneração. Isso é realizado primeiramente fixando a cabeça da mosca ao restante do corpo e cortando-a aberta.Em seguida, o cérebro e outros tecidos são removidos do interior da cabeça. A seguir, a cutícula é removida e cada retina é cortada ao meio. O passo final do procedimento é escavar o O com uma agulha de tungstênio e depositá-los sobre uma lâmina.No final, podem ser obtidos resultados que mostram organelas autofágicas citoplasmáticas por meio de microscopia confocal de fluorescência. A principal vantagem desta técnica é que permite uma análise biológica celular de alta resolução em modelos de drosófila para neurodegeneração, que até agora só podiam oferecer insights genéticos neste campo, demonstrando que o procedimento será variável. Um estudante de pós-graduação do meu laboratório, com a ajuda de Daniel Mackay, técnico em histologia e microscopia do centro.Para começar, preencha um poço de uma lâmina de vidro com três poços com solução salina tamponada com fosfato, em seguida anestesie as moscas com dióxido de carbono. Uma vez anestesiadas, pegue uma única mosca usando pinça e coloque-a no pequeno recipiente com PBS. Sob um microscópio estereoscópico, segure o probóscide com a pinça e, então, separe a cabeça do corpo cortando o pescoço.Usando um segundo par de pin&ccedil;as segurando a cabe&ccedil;a da mosca pelo prob&oacute;scide, corte a cabe&ccedil;a ao meio ao longo da linha m&eacute;dia rostral lateral com tesoura microcir&uacute;rgica. Para expor o c&eacute;rebro, utilize a ponta de uma pipeta cortada para pegar a cabe&ccedil;a com a retina e transferi-la para outro po&ccedil;o contendo meio Schneider. Remova com pin&ccedil;as a maior parte da cut&iacute;cula da cabe&ccedil;a e, em seguida, retire o c&eacute;rebro.Mantenha a retina sanduíche entre a lâmina e a córnea. Em seguida, transfira a retina para uma gota de 50 microlitros de meio Schneider fresco. Colocada diretamente sobre uma lâmina de vidro, segure com pinça uma das extremidades da retina, dorsal ou ventral, usando tesoura microcirúrgica.Corte a retina ao meio ao longo da linha média dorsal-ventral para expor o AMIA no centro do olho. Continue segurando a retina de modo que a córnea fique voltada para baixo e a lâmina voltada para cima. Usando uma agulha fina de tungstênio, solte primeiro o oia da lâmina e depois da córnea.Um único OIA e grupos de OIA irão se acumular no fundo do poço ou lâmina. Remova qualquer resíduo maior que possa ter se acumulado antes de prosseguir. Para analisar autofagia, dilua o rastreador Lito na proporção de um para 1000 em uma gota de meio Schneider, misture e aguarde 10 segundos.Remova o excesso de líquido da lâmina. Tendo o cuidado de deixar o AMIA para trás. Adicione uma gota de Vector Shield para cobrir o AMIA.Aplicar uma lamínula e selar com esmalte para unhas utilizando microscopia confocal, tanto fagossomos marcados com GFP-ATG8 quanto lisossomos marcados por LysoTracker podem ser visualizados em um tédio dissecado de uma mosca que expressa uma forma mutante de atropina. O painel de campo claro no canto superior direito exibe a estrutura quase intacta do tédio, e o quadro indica a área escaneada. Aqui, o vermelho marca os lisossomos e o verde marca o autofagossomo.Os autofagossomos, que resultam da fusão das duas organelas, aparecem amarelos. Após este procedimento, outros métodos, como o cultivo de material e a administração de fármacos, podem ser realizados para responder a diferentes perguntas, como os compostos eficazes nas marcações de autofagia em células neuronais de diferentes origens genéticas.Combinando as vantagens da genética de drosófila com algumas análises biológicas celulares avançadas possíveis em cultura celular.

single-drosophila-ommatidium-dissection-and-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Em insetos, o oenocytes produzir compostos de hidrocarbonetos cuticulares. Estes compostos protegem contra a dessecação e facilitar a comunicação química. Aqui nós demonstramos uma técnica de dissecção usado para isolar o oenocytes de...

Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

O método de imagem vertical descrito neste protocolo permite a visualização detalhada dos pólos de um ovo de Drosophila melanogaster em desenvolvimento.  Essa visão final fornece uma nova perspectiva sobre os arranjos e morfologias de vários tipos de células no epitélio folicular.

Imagem Vertical de<em&gt; Drosophila</em&gt; Câmaras de ovo

O ovário de Drosophila é um sistema excelente modelo para estudar o desenvolvimento de nicho de células-tronco. Embora métodos para dissecando larvas e adultos ovários foram publicados, dissecções de ovário pupal requerem diferentes técnicas que não tenham sido publicadas em detalhe. Aqui nós esboçamos um protocolo para dissecar, coloração e montagem ovários pupal.

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

Em Drosophila,o núcleo oócito sofre migração dependente de microtúbulos durante a oogênese. Aqui, descrevemos um protocolo que foi desenvolvido para acompanhar a migração realizando imagens ao vivo em câmaras de ovos ex-vivo. Nosso procedimento mantém as câmaras de ovos vivas por 12 horas para adquirir filmes de lapso de tempo 3D multi-posição usando microscopia confocal de disco giratório.

Migração Nuclear no Oócito de Drosophila

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e de baixo custo para imagens de alta resolução de olhos adultos de Drosophila para quantificar defeitos de padronização e crescimento. Descrevemos nosso protocolo para preparação de amostras por montagem em ponto, aquisição de imagem de alta resolução e análise de imagem.

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

Aprenda a dissecar e imaginar omatídeos únicos de Drosophila para estudar eventos intracelulares em modelos de neurodegeneração. Este método permite criar culturas primárias de neurônios para análise avançada.

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

Explorar mais vídeos