Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem
19 de agosto de 2011
O fator limitante no uso do adulto Drosophila Olho para estudar neurodegeneração e biologia celular é a imagem difícil de processos intracelulares. Descrevemos a dissecação de omatídeos única para gerar uma boa-fé de cultura de células neuronais primários, que podem ser sujeitos a tratamento medicamentoso e avançados de imagem.
O objetivo geral deste procedimento é dissecar e obter imagens de um único drosophila ou matia para estudar eventos intracelulares em modelos de neurodegeneração. Isso é realizado primeiramente fixando a cabeça da mosca ao restante do corpo e cortando-a aberta.
Em seguida, o cérebro e outros tecidos são removidos do interior da cabeça. A seguir, a cutícula é removida e cada retina é cortada ao meio. O passo final do procedimento é escavar o O com uma agulha de tungstênio e depositá-los sobre uma lâmina.
No final, podem ser obtidos resultados que mostram organelas autofágicas citoplasmáticas por meio de microscopia confocal de fluorescência. A principal vantagem desta técnica é que permite uma análise biológica celular de alta resolução em modelos de drosófila para neurodegeneração, que até agora só podiam oferecer insights genéticos neste campo, demonstrando que o procedimento será variável. Um estudante de pós-graduação do meu laboratório, com a ajuda de Daniel Mackay, técnico em histologia e microscopia do centro.
Para começar, preencha um poço de uma lâmina de vidro com três poços com solução salina tamponada com fosfato, em seguida anestesie as moscas com dióxido de carbono. Uma vez anestesiadas, pegue uma única mosca usando pinça e coloque-a no pequeno recipiente com PBS. Sob um microscópio estereoscópico, segure o probóscide com a pinça e, então, separe a cabeça do corpo cortando o pescoço.
Usando um segundo par de pinças segurando a cabeça da mosca pelo probóscide, corte a cabeça ao meio ao longo da linha média rostral lateral com tesoura microcirúrgica. Para expor o cérebro, utilize a ponta de uma pipeta cortada para pegar a cabeça com a retina e transferi-la para outro poço contendo meio Schneider. Remova com pinças a maior parte da cutícula da cabeça e, em seguida, retire o cérebro.
Mantenha a retina sanduíche entre a lâmina e a córnea. Em seguida, transfira a retina para uma gota de 50 microlitros de meio Schneider fresco. Colocada diretamente sobre uma lâmina de vidro, segure com pinça uma das extremidades da retina, dorsal ou ventral, usando tesoura microcirúrgica.
Corte a retina ao meio ao longo da linha média dorsal-ventral para expor o AMIA no centro do olho. Continue segurando a retina de modo que a córnea fique voltada para baixo e a lâmina voltada para cima. Usando uma agulha fina de tungstênio, solte primeiro o oia da lâmina e depois da córnea.
Um único OIA e grupos de OIA irão se acumular no fundo do poço ou lâmina. Remova qualquer resíduo maior que possa ter se acumulado antes de prosseguir. Para analisar autofagia, dilua o rastreador Lito na proporção de um para 1000 em uma gota de meio Schneider, misture e aguarde 10 segundos.
Remova o excesso de líquido da lâmina. Tendo o cuidado de deixar o AMIA para trás. Adicione uma gota de Vector Shield para cobrir o AMIA.
Aplicar uma lamínula e selar com esmalte para unhas utilizando microscopia confocal, tanto fagossomos marcados com GFP-ATG8 quanto lisossomos marcados por LysoTracker podem ser visualizados em um tédio dissecado de uma mosca que expressa uma forma mutante de atropina. O painel de campo claro no canto superior direito exibe a estrutura quase intacta do tédio, e o quadro indica a área escaneada. Aqui, o vermelho marca os lisossomos e o verde marca o autofagossomo.
Os autofagossomos, que resultam da fusão das duas organelas, aparecem amarelos. Após este procedimento, outros métodos, como o cultivo de material e a administração de fármacos, podem ser realizados para responder a diferentes perguntas, como os compostos eficazes nas marcações de autofagia em células neuronais de diferentes origens genéticas.
Combinando as vantagens da genética de drosófila com algumas análises biológicas celulares avançadas possíveis em cultura celular.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para dissecar e imaginar oomátideos individuais de Drosophila a fim de estudar eventos intracelulares em modelos de neurodegeneração. O método permite a geração de culturas primárias de células neuronais que podem ser submetidas a tratamento com fármacos e técnicas avançadas de imagem.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Neurodegeneração
Antecedentes
- A imagem dos processos intracelulares em Drosophila adulta é desafiadora.
- O dissecção de omatídios individuais fornece uma solução para o estudo de mecanismos celulares.
- Culturas neuronais primárias permitem tratamento com fármacos e imagens avançadas.
- Essa abordagem aprimora a compreensão da neurodegeneração.
Objetivo do Estudo
- Dissecar omarídios de Drosophila para análise celular.
- Facilitar a obtenção de imagens de eventos intracelulares.
- Criar uma plataforma para estudos de tratamento com fármacos.
Métodos Utilizados
- Prenda a cabeça da mosca e corte-a ao meio.
- Remova o cérebro e outros tecidos internos.
- Corte a retina ao meio após remover a cutícula.
- Extraia os omátidios com uma agulha de tungstênio e deposite-os sobre uma lâmina.
Resultados Principais
- Dissecação bem-sucedida de omatídios individuais.
- Criação de culturas primárias autênticas de células neuronais.
- Capacidade de realizar tratamentos farmacológicos em células cultivadas.
- Técnicas avançadas de imagem aplicadas ao estudo de processos intracelulares.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta valiosa para o estudo da neurodegeneração.
- O dissecção de omatídios individuais melhora as capacidades de imagem celular.
- Essa abordagem pode levar a novas descobertas em neurobiologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dissecação e a imagem individual de omatídeos em Drosophila permitem a análise de alta resolução de eventos intracelulares relevantes para a neurodegeneração, superando as limitações da autofluorescência do olho inteiro. Esta técnica auxilia na redução de riscos mecanicistas e na validação de alvos no estágio inicial de descoberta, possibilitando a visualização direta de processos autofágicos e respostas a fármacos em células neuronais geneticamente definidas. Sua adaptabilidade para imagem em tempo real e administração de compostos posiciona-a como uma plataforma reutilizável para fluxos de pesquisa em neurodegeneração.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação direta da autofagia e do tráfego intracelular em células neuronais relevantes para doenças.
- Apóia a validação funcional de alvos ao visualizar respostas subcelulares a perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao distinguir efeitos autônomos em células com fundos genéticos em mosaico.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema validado ex vivo para imagem quantitativa de marcadores autofágicos e lisossomais.
- Permite o preparo reprodutível de amostras de célula única para testes padronizados de compostos.
- Apóia a escalabilidade do ensaio e a reutilização da plataforma para triagem de agentes modificadores da neurodegeneração.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a vias relevantes para doenças ao modelar a disfunção autofágica em um sistema geneticamente manipulável.
- Permite a continuidade da descoberta genética à avaliação pré-clínica de compostos em células neuronais.
- Apóia o avanço ajustado ao risco ao fornecer leituras celulares preditivas para alvos de neurodegeneração.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método conecta a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica ao permitir testes orientados por hipóteses sobre mecanismos intracelulares e efeitos de compostos em um contexto neuronal geneticamente definido.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de autofagia e neurodegeneração em omatídios individuais.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medições baseadas em microscopia confocal de autofagossomos, lisossomos e seus produtos de fusão.
- Pesquisa Translacional: Facilita a correlação entre fenótipos celulares e modelos de doenças, além do desenvolvimento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular adaptável a diversas origens genéticas e bibliotecas de compostos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e nos estudos mecanicistas da neurodegeneração.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de dissecação e imagem em nível de célula única para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento ao fornecer evidências celulares diretas do engajamento do alvo e da eficácia do composto.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de neurodegeneração e candidatos terapêuticos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de Drosophila e técnicas de imagem confocal.
- Necessita de acesso à microscopia de fluorescência e infraestrutura de cultura celular.
- Exige padronização entre equipes para protocolos de preparação de amostras e aquisição de imagens.
- Adaptável a diversas linhagens genéticas utilizando técnicas de análise em mosaico.
- Limitado à análise ex vivo; pode ser necessária validação in vivo para continuidade translacional.
