Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

O objetivo geral deste procedimento é produzir um modelo de câncer oral em camundongo que permita a visualização e quantificação da invasão tumoral na língua. Isso é realizado primeiramente gerando células de carcinoma espinocelular oral para imagem de dois fótons por meio da infecção lentiviral com life Act M cherry e seleção clonal estável. Em seguida, tumores alogrênicos ortotópicos são produzidos em camundongos nu por injeção de células marcadas com life Act M cherry nas línguas de camundongos anestesiados.

Em seguida, línguas contendo tumores são analisadas por microscopia de dois fótons. Por fim, podem-se obter resultados que mostram a invasão local quantificada de tumores orais dentro do músculo da língua por meio da imagem de dois fótons de tecido lingual fresco e da subsequente reconstrução tridimensional assistida por computador de tumores primários e grupos celulares invadidos regionalmente. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como imuno-histoquímica ou imagem bioluminescente, é que a invasão de células tumorais pode ser medida quantitativamente em três dimensões.

As implicações desta técnica estendem-se à intervenção terapêutica no câncer oral, pois fornece um sistema modelo para a análise de proteínas envolvidas na invasão tumoral, bem como para a avaliação de compostos pré-clínicos em estratégias terapêuticas anti-invasivas. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades, pois a injeção de células tumorais na língua e o preparo da língua para a microscopia de dois fótons são tecnicamente desafiadores, exigindo habilidade e prática. A visualização deste método é essencial, já que a injeção tumoral em etapas de dois fótons é difícil de aprender e requer habilidade especializada para iniciar o cultivo.

Linhas celulares de tumores de cabeça e pescoço humanos em meio completo composto por DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de aminoácidos não essenciais. Para transferir a sequência de revestimento LIFE Act M cherry para o vetor lentiviral PLL 7.0, é necessário primeiro realizar mutagênese direcionada a sítios para introduzir três mutações silenciosas no sítio de reconhecimento SBF um presente no CD NA parental do mCherry. Em seguida, amplificar por PCR a sequência modificada do Life Act mCherry com sítios flanqueadores ECO R um e SBF um e subclonar no PLL 7.0. Para gerar um construto PLL 7.0 LIFE Act M cherry seguindo um sistema de expressão lentiviral, cultivar a linhagem celular empacotadora 2 9 3 T 17 até 40% de confluência em meio completo.

Usando Cal Foss, transfecte as células com os vetores PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS dois e P-V-S-V-G em uma proporção de três para dois para um, respectivamente. Após 24 horas, substitua o meio por meio completo fresco, colete e reponha o meio a cada 12 horas durante 72 horas, armazenando o meio coletado a quatro graus Celsius para gerar linhagens celulares de cabeça e pescoço com expressão estável de LIFE Act M cherry. Centrifugue o meio coletado a 2000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius, adicionando um mililitro do meio clarificado contendo o vírus às células OSC 19 ou US CCC uma durante 12 horas.

Lave as células, em seguida adicione mais um mililitro de vírus por um período adicional de 12 horas. Incube as células em meio contendo 200 miligramas por mililitro de puromicina por duas semanas para selecionar colônias resistentes. Analise visualmente as colônias sobreviventes quanto à viabilidade e à expressão de Act m cherry por microscopia de fluorescência. Tripsinize colônias positivas individuais utilizando discos de clonagem estéreis de três milímetros.

Mantenha as células positivas em meio contendo 200 miligramas por mililitro de puromicina até o congelamento ou até o uso para injeção ortotópica para gerar um xenoenxerto de tumor ortotópico trypsin life Act. M cherry. Em seguida, centrifugue o cultivo e reconstitua cerca de 2,5 vezes 10 à quarta células em 50 microlitros de meio completo. Carregue as células tumorais em uma seringa de um mililitro acoplada a uma agulha de 27 gauge e meia polegada.

A seguir, anestesie uma fêmea atímica de oito semanas de idade. Um camundongo nu com uma combinação de 80 miligramas por quilograma de ketamina e 10 miligramas por quilograma de xilazina. Assim que o animal parar de se mover, aplique pomada lubrificante nos olhos e verifique a resposta pressionando a unha na planta do pé.

Mantenha os camundongos sobre uma placa aquecida entre 37 e 40 graus Celsius. Usando pinças estéreis, segure suavemente a ponta da língua e puxe-a para fora da cavidade oral. Injete lentamente as células em um dos lados de cada língua para criar uma massa bulbosa no centro da língua.

Administre aos camundongos 2,1 miligramas por quilograma de yohimbina e retorne-os à placa aquecida para monitorá-los durante a recuperação da anestesia. Coloque os camundongos em gaiolas estéreis contendo uma dieta macia de biscoito transgênico. Pese os camundongos a cada dois ou três dias e monitore-os visualmente quanto ao aparecimento de tumores.

Para preparar línguas de camundongos para imagem ex vivo, eutanazie camundongos portadores de tumores em diferentes pontos temporais. Utilizando inalação de dióxido de carbono, extraia as línguas e enxágue-as com uma vez PBS. Em seguida, utilize linha de pesca monofilamentar de uma loja de artesanato local e uma agulha de costura número oito.

Fixe a língua a um lado de um cassete convencional para inclusão de tecidos em parafina. Uma vez que a língua esteja imobilizada, mergulhe todo o conjunto do cassete em um XPBS. Processe imediatamente as línguas utilizando microscopia de dois fótons para imaginar as línguas por microscopia de dois fótons.

Mergulhe as cassetes linguais em uma placa de 60 milímetros contendo um XPBS. Fixe a placa em um suporte de design personalizado em um braço em balanço retrátil posicionado sob a objetiva do microscópio de dois fótons. Coloque uma objetiva de imersão em água de 40 x 0,8 de abertura numérica diretamente sobre ou acima de uma lesão tumoral visível.

Image a língua por microscopia de dois fótons com o laser de titânio safira com intensidade de 60 miliwatts e comprimento de onda de entrada de 755 nanômetros. Para otimizar o sinal de M cherry, colete imagens seriadas de varredura a laser de um micrômetro em incrementos de um micrômetro ao longo de uma profundidade tecidual total entre 15 e 100 micrômetros. Com essa configuração, tumores com até um milímetro de profundidade tecidual podem ser analisados.

Utilize o Scan Image para capturar imagens. O Scan Image gera uma saída de dois canais com padrões de varredura raster para controlar os espelhos galvanométricos de varredura XY e, ao mesmo tempo, captura simultaneamente um sinal de entrada de até quatro canais proveniente de tubos fotomultiplicadores por meio de uma placa de aquisição de dados. O Scan Image coleta imagens em pilha Z controlando o eixo Z do objetivo e adquire imagens de lapso de tempo em modo único ou cíclico.

Salve as imagens em um único arquivo TIF com profundidade de 16 bits. Usando o software Amira, processe pilhas de imagens de tumor em uma única imagem tridimensional abrindo o arquivo TIF que contém o conjunto de imagens em pilha Z. Utilize a função TEX para gerar uma renderização tridimensional.

Uma grande imagem de tumor primário com vários grupos invasivos dissociados menores, ou GIs, provavelmente estará presente na imagem renderizada. Para medir o volume do tumor, defina o limiar da área do tumor primário e de cada corte da pilha de imagens, corrigindo e eliminando a fluorescência de fundo. Repita o procedimento de limiarização para cada grupo invasivo.

Após a seleção do tumor primário e de todos os GIs, determine a medida do volume, bem como as coordenadas OID X, Y e Z do tumor primário. Para calcular as distâncias dos GIs a partir do ponto central do tumor, calcule o índice invasivo do tumor ou TI usando a fórmula TI igual a N NT vezes VT vezes dt. Onde NT equivale ao número total de GIs na imagem, VT equivale ao volume total de todos os GIs e DT equivale à distância total percorrida por todos os grupos invasivos a partir do centro do tumor primário.

Renderizações tridimensionais com maior detalhe topográfico podem ser geradas importando os arquivos originais de ponta monocromáticos de 16 bits no software Nikon NIS Elements. Crie um arquivo ND a partir de uma pilha de imagens. Em seguida, calibre manualmente o documento para especificar o tamanho do pixel, obtendo renderizações de maior qualidade.

Adicione cortes adicionais no plano Z. Esta figura mostra um exemplo dos dados brutos adquiridos a partir de uma imagem de dois fótons no NIS elements ou em um espelho. Pode-se utilizar um software para reconstruir os dados brutos de tumores da língua, como mostrado nesta figura.

Este painel mostra um exemplo da renderização tridimensional utilizando a função TEX no software Amira. Aqui há um exemplo de limiarização de uma seção individual de dois fótons proveniente da pilha de imagens, para identificar grupos invasivos a partir do tumor primário, bem como o centro ou oide do tumor primário. Após a análise de cada seção com limiarização, o Amira quantifica o volume e a distância percorrida por cada grupo invasivo a partir do Centro.

Esses dados podem ser demonstrados graficamente e utilizados para obter o valor numérico do grau completo de invasão das células tumorais. Imagens representativas de tumores visualizados por meio de marcação imuno-histoquímica patológica convencional, comparadas a uma imagem tridimensional de um tumor semelhante utilizando o protocolo descrito, são apresentadas aqui como referência. Uma vez dominada a técnica, desde a extração da língua até a renderização final em 3D, ela pode ser realizada em cerca de duas horas, se adequadamente executada. Ao tentar este procedimento, tenha cuidado para não perfurar a língua com a agulha, evitando assim a perda de células tumorais e o comprometimento do enxerto tumoral. Após este procedimento, testes com compostos terapêuticos ou células com níveis proteicos manipulados podem ser realizados para determinar sua eficácia sobre a invasão do câncer bucal.

Em um ambiente in vivo, não se esqueça de que trabalhar com células tumorais humanas modificadas com lentivírus é perigoso; precauções, como o uso adequado de EPIs e o trabalho em uma cabine de fluxo laminar certificada em Nível Biossegurança 2, devem sempre ser tomadas ao manipular camundongos injetados.