Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Uma visão abrangente das técnicas envolvidas na geração de um modelo do rato de câncer oral e monitorização quantitativa de invasão tumoral dentro da língua por meio de microscopia multi-fotão de células marcadas é apresentado. Este sistema pode servir como uma plataforma útil para a avaliação molecular e eficácia de drogas anti-invasivos compostos.

O objetivo geral deste procedimento é produzir um modelo de câncer bucal em camundongos que permita a visualização e quantificação da invasão tumoral na língua. Isso é feito pela primeira geração de células de carcinoma escamoso oral para duas imagens de fótons por infecção lentiviral da cereja do Ato M da vida e seleção clonal estável. Em seguida, os tumores ortotópicos de xenoenxerto são produzidos em camundongos nus por injeção de células marcadas com cereja do Ato M da vida nas línguas de camundongos anestesiados.

Em seguida, o tumor contendo línguas é visualizado por microscopia de dois fótons. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram invasão tumoral oral local quantificada dentro do músculo da língua por meio de duas imagens de fótons de tecido fresco da língua e subsequente reconstrução tridimensional auxiliada por computador de tumores primários e grupos celulares invadidos regionalmente. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como imuno-histoquímica ou imagem bioluminescente, é que a invasão de células tumorais pode ser medida quantitativamente em três dimensões.

As implicações desta técnica estendem-se para a intervenção terapêutica do cancro oral, pois fornece um sistema modelo para a análise de proteínas envolvidas na invasão tumoral, bem como para a avaliação de compostos pré-clínicos em estratégias terapêuticas anti-invasivas. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades, pois a injeção das células tumorais na língua e a preparação da língua para duas microscopias fotográficas é tecnicamente exigente, exigindo habilidade e prática. A visualização deste método é crítica, pois a injeção do tumor em duas etapas de fótons é difícil de aprender e requer habilidade especializada para iniciar a cultura.

Linhagens celulares de tumores de cabeça e pescoço humanos em meio completo consistindo de DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de estreptomicina de penicilina e 1% de aminoácidos não essenciais. Para transferir a sequência de revestimento de cereja LIFE Act M para o local do vetor lentiviral PLL, a mutagênese direcionada é primeiro necessária para introduzir três mutações silenciosas no SBF, um local de reconhecimento no mCherry CD NA. Em seguida, a PCR amplifica a sequência mCherry do Modified Life Act com flanqueamento ECO R um SBF um local e sub clent no PLL 7.0. Para gerar uma construção de cereja PLL 7.0 LIFE Act M após uma cultura de sistema de expressão lentiviral, a linha celular de empacotamento 2 9 3 T 17 a 40% confluência em meio completo.

Usando Cal Foss, transfecte as células com os vetores PLL 7.0, LIFE Act M, cereja, PS, PACS dois e P-V-S-V-G em uma proporção de três para dois para um, respectivamente. Após 24 horas, substitua o meio por meio fresco e completo, colete e reabasteça o meio a cada 12 horas por 72 horas e armazene o meio coletado a quatro graus Celsius para produzir linhagens celulares de cabeça e pescoço com expressão de cereja Act M de vida estável. Gire o meio coletado a 2000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius, adicione um mililitro do meio clarificado contendo o vírus às células OSC 19 ou US CCC one por 12 horas.

Enxágue as células e adicione mais um mililitro de vírus por mais 12 horas. Cultivar as células em meio contendo 200 miligramas por mililitro de pur micina durante duas semanas Para seleccionar as colónias resistentes, seleccionar visualmente as colónias sobreviventes para toda a vida. Expressão de cereja por microscopia de fluorescência olhos de tripsina, colônias positivas individuais usando discos de clonagem estéreis de três milímetros.

Mantenha as células positivas em meio contendo 200 miligramas por mililitro de pur micina até congelar, ou usado para injeção ortotópica para gerar um tumor ortotópico xenoenxerto tripsina vida Act. M cereja expressando células tumorais, em seguida, centrifugue a cultura e ressuspenda cerca de 2,5 vezes 10 para as células quarto em 50 microlitros de meio completo. Carregue as células tumorais em uma seringa de um mililitro presa a uma agulha de calibre 27 de meia polegada.

Em seguida, anestesiar, raposa atímica fêmea de oito semanas de idade. Um camundongo nu com uma combinação de 80 miligramas por quilo de cetamina e 10 miligramas por quilograma de xilazina. Assim que o animal parar de se mover, aplique pomada de lubrificação ocular e verifique a capacidade de resposta pressionando a unha na pata.

Mantenha os ratos em uma almofada de aquecimento entre 37 e 40 graus Celsius. Usando uma pinça estéril, segure suavemente a ponta da língua e puxe-a para fora da cavidade oral. Injete lentamente as células em um lado de cada língua para criar uma massa bulbosa no centro da língua.

Injete os camundongos com 2,1 miligramas por quilograma de yohi e devolva-os à almofada de aquecimento para monitorá-los durante a recuperação da anestesia. Coloque os ratos em gaiolas estéreis contendo uma dieta de massa transgênica macia. Pese os camundongos a cada dois ou três dias e monitore-os visualmente quanto ao aparecimento do tumor.

Para preparar línguas de camundongos para imagens ex vivo, eutanasiar camundongos que abrigam tumores em diferentes momentos. Usando a inalação de dióxido de carbono, extraia as línguas e lave-as com um XPBS. Em seguida, use linha de costura monofilamento de uma loja de hobby local e uma agulha de costura tamanho oito.

Prenda a lingueta a um lado de um convencional de incorporação de tecido de parafina. Assim que a lingueta estiver imobilizada, mergulhe todo o conjunto do em um XPBS. Processe imediatamente as línguas usando microscopia de dois fótons para obter imagens das línguas usando microscopia de dois fótons.

Mergulhe os de língua em um prato de 60 milímetros contendo um XPBS. Prenda o prato em um suporte de design personalizado em um braço cantilever retrátil posicionado sob a objetiva do microscópio de dois fótons. Coloque uma lente objetiva de imersão em água de abertura numérica de 40 x 0,8 diretamente sobre ou sobre uma lesão tumoral visível.

Imagem da língua por microscopia de dois fótons com o laser de safira de titânio com uma intensidade de 60 miliwatts e um comprimento de onda de entrada de 755 nanômetros. Para otimizar o sinal M cherry, colete imagens seriais de varredura a laser de um micrômetro em profundidades incrementais de um micrômetro em uma profundidade total de tecido entre 15 e 100 micrômetros. Com essa configuração, tumores de até um milímetro de profundidade de tecido podem ser analisados.

Use a imagem de digitalização para capturar imagens. A imagem de varredura gera uma saída de dois canais de padrões de varredura raster para controlar os espelhos de varredura métrica XY galvan e, ao mesmo tempo, captura uma entrada de sinal máxima de quatro canais simultaneamente de tubos multiplicadores de fotos através de uma placa de aquisição de dados. A imagem de varredura coleta imagens de pilha Z controlando o eixo Z da objetiva e coleta imagens de lapso de tempo em um modo único ou cíclico.

Salve as imagens em um único arquivo TIF com profundidade de 16 bits. Usando o software Amira, renderize pilhas de imagens de tumores em uma única imagem tridimensional, abrindo o arquivo TIF contendo o conjunto de imagens da pilha Zs. Use a função TEX para gerar uma renderização tridimensional.

Uma grande imagem de tumor primário com vários grupos invasivos dissociados menores ou igs provavelmente estará presente na imagem renderizada. Para medir o volume do tumor, defina o limite da área do tumor primário e cada fatia da pilha de imagens corrija e elimine a fluorescência de fundo. Repita o procedimento de limiar para cada grupo invasivo.

Uma vez que o tumor primário e todos os igs são selecionados, determine a medição do volume, bem como as coordenadas OID do tumor X, Y e Z para o tumor primário. Para calcular as distâncias de igs do ponto central do tumor, calcule o índice de invasividade tumoral ou ti usando o ti igual a N NT vezes VT vezes dt. Onde NT é igual ao número total de igs na imagem, VT é igual ao volume total de todos os igs e DT é igual à distância total percorrida por todos os grupos invasivos a partir do centro do tumor primário.

Renderizações tridimensionais com maior detalhe topográfico podem ser geradas importando os arquivos originais de ponta monocromática de 16 bits para os elementos Nikon NIS dentro do software. Crie um arquivo ND a partir de uma pilha de imagens. Em seguida, calibre manualmente o documento para especificar o tamanho do pixel para renderizações de maior qualidade.

Adicione fatias adicionais no plano Z. Esta figura mostra um exemplo dos dados brutos adquiridos de uma imagem de dois fótons, elementos NIS ou um espelho. O software pode ser usado para reconstruir os dados brutos dos tumores de língua, o que é mostrado nesta figura.

Este painel mostra um exemplo da renderização tridimensional usando a função TEX no software Amira. Aqui está um exemplo de limiar de uma seção individual de dois fótons da pilha de imagens para identificar grupos invasivos do tumor primário, bem como do centro do tumor primário ou oid. Depois que cada seção do limiar é analisada, Amira quantifica o volume e a distância percorrida por cada grupo invasor do Centro.

Esses dados podem ser demonstrados graficamente e usados para obter o valor numérico para o nível completo de invasão de células tumorais. Atribuíveis ao local primário mostrado aqui são imagens representativas de tumores visualizadas pela marcação imuno-histoquímica patológica convencional em comparação com uma imagem tridimensional de um tumor semelhante usando o protocolo descrito Uma vez dominada desde o ponto de extração da língua até a renderização 3D final, esta técnica pode ser feita em cerca de duas horas se realizada corretamente durante a tentativa deste procedimento, tome cuidado para não perfurar a língua com a agulha, perdendo assim as células tumorais e impedindo a tomada do tumor Após este procedimento. Testes de compostos terapêuticos ou células com níveis de proteína manipulados podem ser realizados para determinar sua eficácia na invasão do câncer bucal.

Em um ambiente in vivo, não se esqueça de que trabalhar com células tumorais humanas modificadas com lentivírus é perigoso, precauções como EPI adequado e trabalhar em uma capa de fluxo laminar certificada BSL dois devem sempre ser tomadas ao trabalhar com camundongos injetados.