Name: Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprenda a gerar aptâmeros de RNA anti-HIV gp120 com alta afinidade usando SELEX em filtro de nitrocelulose. Este método permite selecionar moléculas específicas para terapia antirretroviral direcionada.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer e Lisa Scherer para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e AI29329 HL07470 concedido a JJR Os seguintes reagentes foram obtidos através da AIDS NIH Programa de Pesquisa e de reagente de referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH: O CHO-EE e CHO-gp160 celular linha, a pNL4-3 luc vetor; HIV-1 BaL gp120 de DAIDS, NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R e JZ tem uma patente pendente em &quot;sistema de entrega de celular tipo específico aptamer siRNA para HIV-1 terapia&quot;. USPTO, No.<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, Data de publicação: 11 de junho de 2009.

Aptâmeros são in vitro evoluiu ácidos nucléicos que assumem específica e estável formas tridimensionais, proporcionando assim altamente específico, forte ligação às moléculas alvo 8. A afinidade nanomolar baixa ligação e especificidade requintado de aptâmeros a seus alvos torná-los ferramentas versáteis para diagnóstico, in vivo de imagem e terapêutica 9. Com o advento da tecnologia aptamer para entrega siRNA alvo agora é possível usar a função de ligação para aptamer end...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> MF-Millipore filtro de membrana </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> Tamanho dos poros 0,45 mM </td></tr><tr><td> Swinnex titular Filtro </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm de diâmetro </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> Purificação de DNA </td></tr><tr><td> Microcontrolador YM-30 coluna </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> Concentração de RNA </td></tr><tr><td> Bio-spin coluna 30 </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> Purificação de RNA </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase PCR </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe T7 Kit transcrição </td><td> Epicentro </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP para PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ribonucléico, transferência de E.coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> concorrente tRNA </td></tr><tr><td> HIV-1 Ba-L proteína gp120 </td><td> a Pesquisa da AIDS e do Programa de reagente de referência </td><td> 4961 </td><td> Proteína alvo </td></tr><tr><td> Silencer kit rotulagem siRNA - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fenol / clorofórmio 01/05 solução (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Clorofórmio / isopropanol 24 / 1 solução </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Bezerro de fosfatase intestinal (CIP) </td><td> New England BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> Quinase T4 polinucleotídeo </td><td> New England BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Glicogênio </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> RNA precipitação </td></tr><tr><td> Gamma-P de 32 ATP </td><td> MP Biomédica </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> Nacional Diagnostics </td><td> CE-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Nacional Diagnostics </td><td> CE-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;tetrametiletilenodiamina (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Persulfato de amônio (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI Mídia 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de bicarbonato de sódio, 7,5% w / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Meio Essencial Mínimo (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM ácido não-aminoácidos essenciais (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA cloning kit com pCR 2,1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de células de tipo específico anti-hiv gp120 aptâmeros para entrega sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

A epidemia global de infecção por HIV criou uma necessidade urgente de novas classes de agentes anti-retrovirais. A potente capacidade da pequena interferência (si) RNA para inibir a expressão de transcritos complementares RNA está sendo explorado como uma nova classe de tratamentos para uma variedade de doenças incluindo o HIV. Muitos relatórios anteriores mostraram que o romance baseado em RNAi anti-HIV/AIDS estratégias terapêuticas têm a promessa considerável, no entanto, um obstáculo chave para o êxito da aplicação terapêutica e tradução clínica de siRNAs é a entrega eficiente. Particularmente, considerando a segurança e eficácia de terapias baseadas em RNAi, é altamente desejável desenvolver uma abordagem de entrega prevista intracelular siRNA para populações de células ou tecidos específicos. O HIV-1 proteína gp120, uma glicoproteína do envelope na superfície do HIV-1, desempenha um papel importante na entrada do vírus nas células CD4. A interação de gp120 e CD4 que desencadeia HIV-1 de entrada e inicia a fusão celular foi validado como clinicamente relevante estratégia anti-viral para a descoberta de drogas. Aqui, nós em primeiro lugar discutir a seleção e identificação de 2&#39;-F modificado anti-HIV gp120 aptâmeros RNA. Utilizando um método convencional SELEX nitrocelulose filtro, várias aptâmeros novo com afinidade nanomolar foram isolados a partir de 50 nt RNA aleatórias biblioteca. A fim de conseguir obter espécies presos com maior afinidade, o rigor de seleção é cuidadosamente controlado, ajustando as condições. O aptâmeros selecionados podem se ligam especificamente e ser rapidamente internalizado nas células expressando a proteína do HIV-1 envelope. Além disso, o aptâmeros sozinho pode neutralizar o HIV-1 infectividade. Com base no melhor aptamer A-1, também criamos um romance dupla função inibitória anti-gp120 aptamer siRNA-quimera em que ambos os aptamer e as porções siRNA têm potentes atividades anti-HIV. Além disso, nós utilizamos a gp120 aptamer siRNA-quimeras para a célula do tipo de entrega específico do siRNA para HIV-1 células infectadas. Esta dupla função quimera mostra um potencial considerável para a combinação de vários agentes terapêuticos de ácido nucléico (aptamer e siRNA) na infecção por HIV-1 suprimindo, tornando-as quimeras aptamer siRNA atraente candidatos terapêuticos para pacientes com falha terapêutica anti-retroviral altamente ativa (HAART).

Vários aptâmeros 2&#39;Fluoro-RNA contra o HIV-1BA-L gp120 com nanomole afinidade são isolados de uma biblioteca por RNA<em&gt; In vitro</em&gt; Processo de SELEX. A nova dupla função inibitória anti-gp120 aptamer siRNA-quimera é criado e mostra a promessa considerável para a terapia anti-HIV sistêmica.

Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

A epidemia global de infecção pelo HIV criou uma necessidade urgente de novas classes de agentes antirretrovirais. A potente capacidade de pequenos interferentes...

O objetivo geral dos experimentos a seguir é gerar RNA Aptima in vitro para a proteína HIV um GP um 20 utilizando uma membrana de nitrocelulose. Isso é obtido por PCR e subsequente transcrição in vitro pela polimerase T sete. Para preparar o DNA inicial e a biblioteca de RNA aleatório, como segundo passo, a mistura da proteína alvo e da biblioteca de RNA é aplicada em um filtro de nitrocelulose previamente umedecido, o que permite o isolamento de moléculas de RNA ligadas das espécies de RNA não ligadas.Após 12 ciclos de seleção, a biblioteca de RNA é clonada e sequenciada para identificar os candidatos individuais de aptâmeros de RNA a partir da bibli游戏副本A sequência da biblioteca de oligonucleotídeos de DNA de fita simples tem 81 nucleotídeos de comprimento. Conforme mostrado neste diagrama, a região aleatória é cercada por regiões constantes: um tumor de 30 no extremo cinco primo e um 16 MA no extremo três primo. As regiões constantes incluem o promotor T sete para transcrição in vitro e uma etiqueta três primo para R-T-P-C-R.Amplifique a biblioteca aleatória de oligonucleotídeos de DNA de fita simples por PCR, limitando a PCR a 10 ciclos para preservar a abundância da biblioteca

development-cell-type-specific-anti-hiv-gp120-aptamers-for-sirna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Compreender as conformações dos antígenos de superfície viral é necessário para avaliar a neutralização de anticorpos e orientar o projeto de imunógenos vacinais eficazes. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite o estudo do reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 expresso na superfície das células transfectadas por anticorpos anti-Env específicos.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um bivalente adenovírus tipo 5 (Ad5) vector de prova de princípio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, utilizando a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Este vector foi demonstrado que exibem aptidão qualitativa, a capacidade de escapar soros Ad5-positiva, in vitro, e a antigenicidade, bem como a imunogenicidade dos antigénios incorporados.

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Métodos para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA visando etapas pós-integração do ciclo de replicação do HIV-1 são descritos. Esses métodos são úteis para rastrear novas moléculas e otimizar o formato das existentes.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Uma abordagem modular para a síntese de N- os glicanos para fixação a um vidro revestido de óxido de alumínio slide (slide ACG) como desenvolveu um microarray glicano e demonstrou-se seu uso para a criação de perfil de um HIV amplamente neutralizando anticorpos.

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

Um método detalhado é fornecido aqui descrevendo a purificação, o redobramento, e a caracterização de nanopartículas de proteína Self-montagem (SAPNs) para o uso no desenvolvimento da vacina.

Produção de E. coli-expressa auto-montagem de nanopartículas de proteína para vacinas que requerem Trimeric epitope apresentação

O padrão de glicosylation de um anticorpo determina seu desempenho clínico, assim persistem os esforços industriais e acadêmicos para controlar a glicosylation. Uma vez que as campanhas típicas de glicoengenia são tempo e trabalhoso, a geração de um protocolo rápido para caracterizar o impacto dos genes de glicosylação usando silenciamento transitório seria útil.

Glicoengenia de anticorpos rápidos em células de ovário de hamster chinês

Fornecemos um protocolo que pode ser geralmente aplicado a aptâmeros selecionados que se ligam apenas a vírus infecciosos e não a vírus que foram tornados não infecciosos por um método de desinfecção ou a quaisquer outros vírus semelhantes. Isso abre a possibilidade de determinar o estado de infectividade em testes portáteis e rápidos.

Seleção In Vitro de Aptamers para Diferenciar Vírus Infecciosos de Não-Infecciosos

Aprenda a gerar aptâmeros de RNA anti-HIV gp120 com alta afinidade usando SELEX em filtro de nitrocelulose. Este método permite selecionar moléculas específicas para terapia antirretroviral direcionada.

Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

Explorar mais vídeos