Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

O objetivo geral dos experimentos a seguir é gerar RNA Aptima in vitro para a proteína HIV um GP um 20 utilizando uma membrana de nitrocelulose. Isso é obtido por PCR e subsequente transcrição in vitro pela polimerase T sete. Para preparar o DNA inicial e a biblioteca de RNA aleatório, como segundo passo, a mistura da proteína alvo e da biblioteca de RNA é aplicada em um filtro de nitrocelulose previamente umedecido, o que permite o isolamento de moléculas de RNA ligadas das espécies de RNA não ligadas.

Após 12 ciclos de seleção, a biblioteca de RNA é clonada e sequenciada para identificar os candidatos individuais de aptâmeros de RNA a partir da bibli游戏副本

A sequência da biblioteca de oligonucleotídeos de DNA de fita simples tem 81 nucleotídeos de comprimento. Conforme mostrado neste diagrama, a região aleatória é cercada por regiões constantes: um tumor de 30 no extremo cinco primo e um 16 MA no extremo três primo. As regiões constantes incluem o promotor T sete para transcrição in vitro e uma etiqueta três primo para R-T-P-C-R.

Amplifique a biblioteca aleatória de oligonucleotídeos de DNA de fita simples por PCR, limitando a PCR a 10 ciclos para preservar a abundância da biblioteca original de DNA. Após as reações de PCR, o pool amplificado de DNA de dupla fita é recuperado utilizando um kit de purificação em gel. O DNA de dupla fita é então convertido em uma biblioteca de RNA usando o kit cript, de acordo com as instruções do fabricante, na mistura de reação de transcrição, substituindo CTP e UTP por duas pirimidinas fluoretadas, CTP e UTP pirimidina fluoretada, para produzir RNA resistente à ribonuclease.

Quando as reações de transcrição estiverem concluídas, digira as reações com DS um para remover o DNA molde e purifique em gel de poliacrilamida a 8%, com ureia sete molar. Por fim, quantifique a biblioteca de RNA purificada por espectrofotometria UV. Antes da seleção de optimas, prepare os buffers necessários e armazene-os nas temperaturas apropriadas.

Tampão Heaps à temperatura ambiente e tampões para refoldagem de RNA e ligação de RNA a menos 20 graus Celsius. Antes de iniciar o primeiro ciclo de seleção, pré-incube a piscina aleatória de RNA em um filtro de nitrocelulose previamente umedecido à temperatura ambiente por 30 minutos para minimizar a ligação inespecífica com o filtro. Após 30 minutos, remova o filtro de nitrocelulose.

Combine a piscina de RNA aleatório pré-limpa e a proteína HIV one bowel GP one 20 em tampão de ligação de RNA de baixa salinidade, incube em plataforma rotatória à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, passe a reação através de um filtro de nitrocelulose previamente umedecido e lave com um mililitro de tampão de ligação de RNA de baixa salinidade para eluir o RNA ligado ao filtro. Remova a membrana de nitrocelulose do suporte do filtro.

Adicione 200 microlitros de tampão de eluição à membrana e aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos. Após o RNA ter sido eluído do filtro, centrifugue o tubo brevemente, transfira a solução de RNA para um novo tubo e realize uma extração com fenol-clorofórmio no eluato. Use uma coluna MicroCon YM 30 para concentrar o RNA e elua o RNA recuperado com 20 microlitros de água livre de RNAses.

A coleção de RNA recuperada é então revertida, transcrita e amplificada por 15 ciclos de PCR. Após a coleção dupla fita amplificada ser purificada, ela é transcrita em uma nova coleção de RNA conforme demonstrado anteriormente antes da próxima rodada de seleção. Refaça a estrutura da coleção de RNA em tampão HBS uma vez, aqueça a 95 graus Celsius por três minutos e, em seguida, deixe esfriar lentamente até 37 graus Celsius.

Continue a incubação a 37 graus Celsius por 10 minutos. Adsorva o RNA renaturado, puxando-o para um filtro de nitrocelulose por 30 minutos antes da incubação com a proteína alvo HIV bowel GP um 20 na próxima rodada de seleção. Para obter com sucesso os aptâmeros com maior afinidade de ligação, a rigidez da seleção deve ser cuidadosamente controlada mediante o ajuste das condições de seleção.

As condições de seleção são mostradas nesta tabela. Para as rodadas de cellex de um a quatro, incubar a população de RNA pré-limpa com a proteína alvo em tampão de ligação de RNA de baixa salinidade por 30 minutos. Após a quarta rodada de cellex, utilizar tampão de ligação de RNA de alta salinidade à medida que o cellex progride.

Reduza a quantidade da proteína GP120 e aumente o RNAt competitivo de levedura para aumentar a rigidez da seleção de aptâmeros em cada ciclo. O progresso da seleção de variantes ótimas de GP120 do HIV-1 é monitorado por um ensaio de ligação em filtro. Neste vídeo, os 12 pools de RNA coletados após todos os ciclos de seleção serão analisados.

Primeiro, remova o trifosfato da extremidade cinco prima inicial tratando cada pool de RNA com fosfatase intestinal de bezerro durante uma hora a 37 graus Celsius. Para preparar o RNA tratado com CIP para marcação com a polinucleotídeo quinase T4 e P32 80 p, aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos, seguido de resfriamento em gelo. A marcação do RNA é realizada em uma sala quente projetada para experimentos envolvendo radioatividade, em tampão PNK, polinucleotídeo quinase T4, um microlitro de ATP gama-P32 e água até completar 20 microlitros. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Após 30 minutos, adicione 20 microlitros de água a cada reação e purifique por uma coluna G 50. Por fim, obtenha 40 microlitros de RNA marcado numa concentração final de 250 nano molar. Reorganize cada pool de RNA marcado em tampão HBS uma vez, aquecendo a 95 graus Celsius por três minutos. Em seguida, deixe esfriar até 37 graus Celsius, o que levará de 30 a 40 minutos.

Continue a incubação a 37 graus Celsius por 10 minutos. Quando a população de RNA tiver sido reenovelada, realize uma reação de ligação de 100 microlitros. Combine a população de RNA marcada na extremidade com a proteína GP um 20 e um excesso molar dez vezes maior de RNA competidor não específico em tampão de ligação de RNA com alto teor salino, incubado à temperatura ambiente por 30 minutos.

Após o término dos 30 minutos, separe 50 microlitros da reação de ligação por meio de um filtro de nitrocelulose pré-umedecido. Em seguida, lave o filtro com dois mililitros de tampão de ligação e conte a radioatividade retida no filtro utilizando um contador de cintilação multipropósito como contagem de controle de entrada. Os 50 microlitros restantes da reação de ligação, ao mesmo tempo, o ensaio de ligação da população de RNA após cada ciclo de seleção foi analisado por um ensaio de ligação em filtro com tRNA competidor para monitorar o progresso do HIV um, GP um 20.

As atividades de ligação da seleção Optima foram calculadas como a porcentagem de RNA inicial retido no filtro como complexo proteína-RNA, conforme mostrado aqui. O pool inicial de RNA mostra apenas 0,1% do RNA inicial retido na membrana. No entanto, após nove rodadas de seleção, a nona biblioteca de RNA apresenta 9,72% do RNA inicial ligado.

Embora rodadas adicionais de seleção tenham sido realizadas, nenhuma enriquecimento adicional foi observado, sugerindo que a ligação máxima da população de RNA já foi alcançada. As atividades de ligação das populações de RNA foram posteriormente confirmadas por ensaios de mobilidade eletroforética em gel. Esses resultados demonstram que alguns ligantes com alta especificidade de ligação para a proteína-alvo são sucessivamente enriquecidos nessas populações de RNA.

Neste exemplo, o 12º pool de RNA apresentou a maior atividade de ligação, já que a ligação máxima do pool de RNA foi alcançada após a 12ª rodada de seleção; esse pool de RNA foi transcrito reversamente para cDNA, que posteriormente foi amplificado por PCR. O produto da PCR foi então purificado e clonado em um vetor de clonagem TA e sequenciado após o alinhamento de 140 clones. Seis grupos de anti GP um 20 optimas foram identificados.

Apenas as sequências aleatórias das regiões centrais do Aptima são indicadas nesta tabela. Cerca de 40% dos clones contêm uma sequência conservada. Uma sequência representativa de cada grupo foi escolhida para caracterização adicional devido à sua abundância relativa dentro do grupo, por meio de um ensaio de deslocamento eletroforético em gel nativo, sendo calculada a constante de dissociação KD desses aptâmeros representativos, por exemplo, A um.

O melhor dos abers apresenta um valor aparente de KD de 52 nanomolar. Como mostrado aqui. Esses abers selecionados podem se ligar seletivamente ao alvo HIV um bowel GP um 20, mas não à proteína H-I-V-G-P um 20 CM células CHO G um 60 que expressam de forma estável a glicoproteína do envelope do HIV GP um 60 foram utilizadas para testar a ligação e a internalização dos optimas anti GP um 20 selecionados.

Essas células não processam a GP um 60 em GP um 20 e G 41, pois carecem das proteases codificadas pelo gag necessárias para o processamento do envelope. A análise por citometria de fluxo revela que os aptâmeros marcados com S3 se ligam especificamente às células CHO GP um 60, mas não às células controle CHO EE, que não expressam a GP um 60. Além disso, a microscopia confocal em tempo real de células vivas no eixo Z indica que, após duas horas de incubação, o aptâmero marcado com SI três é internalizado seletivamente pelas células CHO GP um 60, mas não pelas células controle CHO EE. Também foi observado que o aptâmero se agregou no citoplasma, sugerindo que o aptâmero GP um 20 pode entrar nas células por meio de endocitose mediada por receptor.

Por fim, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão do uso e de como utilizar as medidas baseadas em campo para isolar os RNA Abers.