Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

O objetivo geral deste procedimento é alterar a expressão gênica no sistema nervoso central embrionário do neurônio. Isso é feito primeiro obtendo mulheres grávidas cronometradas e preparando-as para a cirurgia. Os cornos uterinos são então expostos gerando uma incisão abdominal.

Uma vez que os embriões são expostos, o DNA é injetado no ventrículo lateral, terceiro ventrículo ou espaço sub-retiniano. A etapa final do procedimento é aplicar uma corrente elétrica ao embrião através da parede uterina, orientando os eletrodos da pá de forma que o pólo positivo seja colocado sobre o local preferido de transfecção. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a proliferação, migração e diferenciação de neuroprogenitores no quelônio tline morrendo no quelon e na retina por meio de microscopia de imunofluorescência.

A principal vantagem dessa técnica ou dos métodos existentes, como a degeneração de camundongos transgênicos, é que ela é rápida, permite estudos de maior rendimento e tem um custo menor. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento neural, como quais genes regulam o progenitor neural, proliferação celular, especificação do destino celular, diferenciação neuronal e migração celular. As implicações desta técnica podem se estender para uma melhor compreensão das vias genéticas que sublinharam defeitos no desenvolvimento do SNC, muitos dos quais resultam em comprometimento cognitivo e são distúrbios comportamentais em humanos Além de sua utilidade na compreensão do desenvolvimento do sistema nervoso central.

Esta técnica também pode ser aplicada a outros sistemas de órgãos, como o sistema nervoso periférico em desenvolvimento, coração e placenta. Também pode ser aplicado para estudar modelos de doenças em camundongos, bem como em outros organismos modelo, como pintinho e xip. Geralmente, o principal obstáculo ao sucesso para indivíduos novos nesta técnica é o embrião Cuidados de sobrevivência devem ser tomados durante a manipulação, injeção e poragem dos embriões.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando precisávamos de um meio rápido de manipular a expressão gênica no embrionário, no telencéfalo e na retina. Desenvolvemos essa técnica em nosso laboratório modificando a técnica inicialmente descrita por Sal, publicada na revista Developmental Biology em 2001. Também trabalhamos com um laboratório de colisão para estabelecer esse protocolo no dilon em desenvolvimento.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de injeção e eletroporação são difíceis de aprender porque requerem uma manipulação muito cuidadosa dos embriões e os locais de injeção às vezes podem ser muito pequenos. Exemplo, o espaço sub-retiniano Demonstrando o procedimento hoje será Rajiv, um pós-doutorado do Laboratório de Sherman Para começar a limpar e esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas. Em seguida, encha as seringas com solução salina e solução de ringer com lactato e coloque-as em uma almofada de aquecimento para aquecer na área cirúrgica.

Esterilize uma almofada de aquecimento com etanol a 70% e, em seguida, cubra-a com uma compressa de gaze sem mole esterilizada. Defina a almofada de aquecimento para 37 graus Celsius. Coloque o animal em uma pequena câmara anestésica e anestesiado fornecendo 5% de flúor com oxigênio a um litro por minuto através de um vaporizador.

Certifique-se de coletar o escapamento de flúor isof usando um sistema de limpeza. Assim que a respiração do animal for profunda e regular, remova-o da câmara. Use beliscar os dedos dos pés e piscar os olhos.

Para garantir a anestesia completa. Coloque o animal anestesiado de barriga para baixo e use um tubo respirador para fornecer 2,25% de gelo de flúor durante a cirurgia. Injete buprenorfina a uma concentração de 0,1 miligramas por quilograma de peso corporal por via subcutânea na nuca.

Continue a monitorar a respiração do animal e ajuste o fluxo de isde flúor, se necessário. Em seguida, prenda o peito do animal anestesiado e verifique novamente se há uma resposta de retração beliscando o pé traseiro com uma pinça romba. Usando um cotonete estéril, espalhe uma espessa camada de creme de leite no abdômen, garantindo que o pelo esteja completamente revestido.

Deixe o creme agir por aproximadamente três minutos e verifique intermitentemente a depilação. Usando um cotonete estéril, molhe uma gaze estéril com água estéril e limpe o cabelo do abdômen. Em seguida, esterilize o local da incisão com clorexidina e mais água.

Seque o abdômen com gaze estéril limpa. Repita esta etapa com etanol a 70% usando gaze de algodão esterilizado fresco. Prepare-se para a cirurgia vestindo trajes cirúrgicos para expor os chifres uterinos.

Primeiro, localize a alba linear como a linha fraca sob a pele na linha média Usando uma pinça, puxe a pele para longe da parede abdominal e corte uma pequena incisão reta do meio do abdômen para baixo com uma tesoura de pele usando uma pinça curva e uma tesoura. Repita o processo com o peritônio. Segure o peritônio com a pinça.

Afaste-se e, em seguida, faça uma incisão grande o suficiente para puxar o útero. Coloque gaze estéril com uma pequena fenda vertical sobre a incisão e umedeça-a com solução salina estéril quente. Em seguida, deslize a pinça para dentro da incisão e localize o útero mantendo a incisão aberta com a pinça.

Segure o útero entre o primeiro e o segundo embriões visíveis e puxe os dois lados dos chifres uterinos para a gaze. Conte o número de embriões observando qualquer reabsorção ou embriões com tamanho corporal pequeno. Para preparar o número correto de injeções de DNA, molhe os cornos uterinos com solução salina e devolva cuidadosamente um corno uterino ao abdômen.

Para repelir as agulhas cirúrgicas, use uma pipeta puxada para cima com um bocal acoplado para extrair 10 microlitros de três miligramas por mililitro. Solução de DNA livre de endotoxina contendo corante verde de metila e expulsar o DNA em uma agulha cirúrgica. Monte a primeira agulha cheia no micro manipulador.

Fique preso ao injetor começando com o embrião mais próximo do ovário. Use uma pinça circular para girar suavemente o embrião dentro da decídua para que ele fique posicionado com a face para a frente, permitindo que as injeções ocorram em um rolo ROS na direção cordal. Usando uma fonte de luz de fibra óptica para identificar a linha média do cérebro embrionário.

Observe os grandes ventrículos laterais flanqueados nas regiões rostrais. Segure o embrião no lugar usando uma pinça curva e posicione a agulha cirúrgica preenchida acima do útero de forma que o ângulo de entrada no cérebro seja de aproximadamente 45 graus. Com um movimento rápido e constante, gire o botão do micro manipulador para inserir a ponta da agulha através da parede do útero e no ventrículo lateral do cérebro embrionário.

Em seguida, pressione a almofada do microinjetor. Para injetar a solução de DNA, uma injeção bem-sucedida é facilmente visualizada espalhando o corante verde de metila por todos os ventrículos cerebrais embrionários. Agora que o DNA foi injetado, puxe lentamente a agulha de volta para removê-la sem causar quebra.

Coloque o embrião injetado na gaze estéril e molhe bem com solução salina morna. Segure o útero com o pólo positivo do eletrodo da pá colocado sobre o local desejado de transfecção. Em seguida, forneça cinco pulsos elétricos quadrados de 40 a 50 volts e 50 milissegundos a uma taxa de um pulso por segundo.

Cubra o embrião injetado e eletroavaliado com gaze úmida protetora e, em seguida, continue a injetar o próximo embrião. Após a conclusão da injeção e eletroerosão de todos os embriões desejados no corno uterino, empurre-o cuidadosamente de volta para a cavidade corporal. Remova o segundo corno uterino para iniciar a injeção e eletroporação dos embriões restantes.

Quando todos os embriões estiverem de volta ao útero, adicione dois a três mililitros de solução salina quente à cavidade abdominal e, em seguida, remova a gaze do abdômen para revelar os lados do peritônio. Use uma linha de seda trançada preta para suturar o peritônio, ancorando a linha no peritônio mais próximo do esterno e procedendo à costura longe da âncora. Certifique-se de que todas as suturas estejam firmes e que nenhum órgão ou pele subjacente seja costurado no peritônio.

Corte a linha de sutura restante e descarte. Puxe a pele fechada sobre a linha de sutura com uma pinça usando grampos de fechamento da pele. Corte a pele tomando cuidado para não grampear a linha de sutura por baixo ou puxar a pele com muita força.

Uma vez terminado, certifique-se de que os grampos estejam apertados pressionando suavemente com a ferramenta de sutura aqui, A-P-C-I-G dois vetores de expressão que conduzem a expressão de GFP foram eletroporados no neocórtex em desenvolvimento em E 12. À medida que o desenvolvimento neocortical prossegue, os progenitores apicais se diferenciam em progenitores basais secundários ou neurônios pós-mitóticos e continuam a expressar GFP. Essas células neurais podem então ser analisadas quanto à expressão de marcadores típicos do subtipo neural mostrado em vermelho.

Nesta visão venal de um prosencéfalo de um embrião eletroporado em E 12 e dissecado em E 14, o local eletroporado é indicado pela epifluorescência verde em E 14. A expressão de GFP é observada no tálamo, pré-tálamo e hipotálamo, indicando que territórios lic moribundos foram transfectados com sucesso. A caixa do painel marca a localização da seção através de uma zona ventricular.

Um olhar mais atento à zona ventricular mostra a migração de células GFP para fora da zona ventricular e para a zona do manto. Onde os núcleos hipotalâmicos se formarão, a retina embrionária também é prontamente eletroporada, como mostrado neste corte coronal, através de um E 16.5 I eletroporado com PCIC em E 15.5. Aqui, o acúmulo de células m cereja positivas é específico da camada externa de neuroblastos e não é visto em B rrn três células ganglionares da retina B positivas na camada de células ganglionares Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos se não surgirem complicações inesperadas.

Ao tentar este procedimento, é importante usar técnicas estéreis adequadas, uma mão firme ao manipular os embriões e ter todos os materiais necessários prontos antes de colocar a fêmea grávida sob anestesia. Seguindo este procedimento, os embriões eletrotrançados podem viver até a idade adulta, momento em que outros métodos, como ensaios comportamentais e funcionais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como a manipulação de certos genes no embrião afeta a função neuronal no adulto. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do desenvolvimento do SNC explorarem a função gênica in vivo em camundongos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como introduzir DNA estranho no tubo neural embrionário. Especificamente, mostramos como preparar uma mulher grávida para a cirurgia. Exponha o útero, injete DNA e eletrolítico o embrião.

Não se esqueça de que trabalhar com flúor pode ser perigoso, e precauções como um sistema de limpeza devem ser tomadas durante a execução deste procedimento.