Name: Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a medir atividade neuronal olfativa em Drosophila melanogaster por imagem óptica de cálcio no lobo antenal. Este método revela padrões espaciais e temporais de respostas a odores em neurônios geneticamente identificados.

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Reconhecemos Silke Sachse e Beate Eisermann no desenvolvimento desta metodologia, Pablo Traversa para desenhar os planos de blocos de montagem e Daniela Pelz para o uso do esquema na Figura 1. Somos gratos a Silke Sachse, Ramdya Pavan e Rytz Raphael para comentários sobre o manuscrito. R. Bell é apoiado por uma Boehringer Ingelheim Fundação PhD Fellowship. Pesquisas em laboratório R. Benton é financiado por um Conselho Europeu de Investigação Começando Grant pesquisador independente e os suíços National Science Foundation.

1. Assembléia Bloco de Montagem <ol><li> O bloco de montagem plexiglass (Figura 1A) deve ser feita com as especificações exactas dadas no plano (disponível a partir <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) Para permitir a fácil montagem e dissecção da mosca. Fio através dos parafusos da parte de trás, mas não se estendem para além da frente do bloco; sua posição irá ser ajustada durante a preparação do animal (ver 2.7). </li><li> Usando uma broca de precisão, fazer um dente na borda superior da câmara circular para a mosca, escavando sob a superfície para dar espaço para o corpo da mosca, a redução da espessura do bloco neste momento. </li><li> Cortado numa grelha de cobre com um bisturi e perpendicular perto do fundo da fenda para criar um "colarinho". Certifique-se que as duas abas resultantes são de nível, pois isso irá ajudar a inserção da mosca. </li><li> Com um palito, coloque uma pequena gota de supercola para o bloco de montagem acima da câmara circular para a mosca. Coloque a grelha de cobre para a cola e posição de modo que a fenda está centrada sobre o bloco (Figura 1A). Pressione delicadamente e remover qualquer excesso de cola. Com um par de pinças, adicionar pequenas gotas de cola sob as abas de cada lado e dobrar a grade sobre a frente do bloco de modo que a fenda está a apontar para baixo rectas. Assegure-se no topo da grade é nivelada com o bloco. Deixar secar completamente. </li><li> Montar um suporte de fio: corte uma lamela de plástico ao meio e retire uma peça central para fazer um "U". Use cera para colar um pedaço de arame na parte superior do "U", não faça o fio muito esticado. </li><li> Construir o escudo da antena: fazer um buraco em uma lamela de plástico com um furador de papel. Aparar as extremidades da lamela para 0,5 x 0,7 cm. Cole a lamela perfurado plástico para fita adesiva e, em seguida, coloque uma gota de álcool na fita exposta pelo buraco pararemover o adesivo. </li></ol> 2. Preparação dos animais <ol><li> As moscas do genótipo adequado - ou seja, tendo a combinação desejada de "driver" e atividade reporter transgenes - deve ser de 1-3 semanas de idade, a cutícula de moscas mais jovens é muito mole e difícil de cortar. Quando as experiências requerem comparação directa de genótipos diferentes, e de modo a corresponder níveis de expressão do transgene, moscas deve ser idade correspondente para evitar relacionadas com a idade diferenças fisiológicas. Se o género não é importante, nós preferimos usar moscas fêmeas uma vez que têm cabeças maiores e são mais fáceis de manipular. </li><li> Anestesiar moscas por arrefecimento em gelo. </li><li> Introduzir uma única mosca no bloco de montagem. Mantenha a mosca pelo conjunto de asa e deslize-, dorsal de superfície em primeiro lugar, ao longo da fenda da grelha de cobre de modo que é suspensa pela seu pescoço (Figura 1B-C). Se necessário, gire-o até que ele está olhando para baixo. </li><li> Colocar uma espinha fina cacto na frente do fly cabeça do para evitar que se escape (Figura 1B C-). Coloque a coluna cacto na frente dos probóscide para evitar que ela se mova. Fixar a coluna cacto para o bloco usando cera de abelha. Assegure-se que a parte superior da cabeça é nivelada com o topo do bloco. </li><li> Fixar a cabeça da mosca para o bloco com uma pequena gota de colofónia (dissolvido em etanol). Colocar o bloco dentro de uma caixa humidificada e permitir que a colofónia para endurecer durante cerca de uma hora. </li><li> Usando uma pinça, puxe a placa da antena para a frente e soltar o fio no suporte (cera lado-out; ver 1.5) na prega cuticular entre a antena ea cabeça. Fixar o suporte para a frente do bloco com cera de abelha. </li><li> Usando os parafusos embutidos no bloco, empurre o suporte do fio para a frente para criar algum espaço entre a placa da antena ea cabeça. </li><li> Coloque a blindagem antenal (ver 1,6) sobre o topo da cabeça da mosca com o furo posicionado centralmente. Fixar com cera de abelha para o início do bloco de montagem. </li><li> Usando uma lâmina divisor, cuta pequeno orifício na fita sobre o escudo expondo a cutícula da cabeça da mosca por trás da antena. O buraco não deve se estender além dos olhos para evitar a elaboração de vazamento. </li><li> Selar o furo entre a fita ea cutícula com dois componentes de silício. Remova qualquer excesso de silício a partir do topo da cabeça da mosca. </li><li> Colocar uma gota de solução salina (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 36 mM de sacarose, 5 mM de HEPES, pH 7,3) na cabeça de Drosophila de Ringer. Certifique-se que não há vazamentos: as antenas devem ficar completamente seco. Usando uma lâmina de safira, cortar um furo na cutícula. Em primeiro lugar, levemente pontuação ao longo da dobra cuticular directamente por trás da antena, em seguida, cortado ao longo dos olhos e em toda a ocelos na parte traseira. Finalmente, dobram o pedaço de cutícula sobre a borda marcados e cortado a partir do lado de baixo para evitar a separar os nervos antenais. </li><li> Retire cuidadosamente as glândulas e traquéia, com uma pinça fina. Lavar repetidamente com Drosophila </li></ol> 3. Entrega do estímulo Odor <ol><li> Seringas odor: inserir uma almofada de celulose para uma seringa de plástico de 2 ml com uma pinça limpas e pipeta-o (utilizando pontas de filtro) 20 ul de odor, diluídas conforme desejado num solvente apropriado, usando a ponta da pipeta para empurrar a almofada de fundo no barril . Plug and tampa da seringa até serem necessárias. Diluições de odores frescos devem ser preparados pelo menos a cada 3 meses (ou mais freqüentemente para odores altamente voláteis e / ou muitas vezes utilizado), e as pastilhas novas devem estar preparados para seringas odor pouco antes de cada sessão de gravação. Não use esponjas de odor por mais de três estímulos, uma vez que a concentração de odor pode decair. </li><li> Feito por medida olfactómetro (Figura 2): um fluxo de ar primário (1 l / min) é dirigido através de Teflon tubagem (0,4 mm de diâmetro interno); 27 cm a montante da saída deste tubo, um fluxo de ar secundário (1 l / min ) é adicionado. Ambas as correntes de ar são gerados por bombas de membrana, ea taxa de fluxo é regulada por dois fluxómetros independentes. As correntes de ar podem ser humedecido por passagem através de água em garrafas de gás de lavagem, embora deve ser tomado cuidado para evitar o excesso de humidificação-(isto é, mais do que ~ 60%). O fluxo de ar secundário é dirigido através de uma seringa de odor ou uma seringa vazia: seringas são ligados ao fluxo de ar através de uma agulha de seringa (1,2 mm de diâmetro exterior) e penetra o êmbolo. Uma válvula de três vias magnético controlado através de uma unidade de controlador de válvula (VC6 Aparelho Harvard, por exemplo) é usado para comutar entre o ar limpo e estímulo do odor. </li></ol> 4. Imagem in vivo <ol><li> Descrevemos aqui imagens usando um microscópio fluorescente na vertical (por exemplo, na vertical fixos Estágio D1 Zeiss Axio Examiner) equipada com uma objetiva de 20x de água (por exemplo Zeiss W "Plano Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (Figura 2). Para imagens com G-CAMP (excitação / emissão: 488/509 nm), use um bloco de filtro com as seguintes propriedades: 450-490 filtro de excitação nm, Dicróica espelho (T495LP) e 500-550 nm filtro de emissão (Chroma ET). Colocar o bloco de montagem contendo a mosca sob o microscópio. Posicionar a saída dos olfatômetro aproximadamente 0,5 cm à frente da antena da mosca. </li><li> Abaixe o objetivo até que toque a solução de Ringer na cabeça da mosca. Olhando através do visualizador sob iluminação de campo brilhante posição, a preparação de modo que o orifício na cápsula cabeça está centrada e suas fronteiras estão em foco. Mudar para luz fluorescente e ajustar o foco até que você possa ver os neurônios marcados (aparente de fluorescência verde basal do G-CAMP). </li><li> Focagem fina glomérulos de interesse através da aquisição de imagens com um dispositivo de carga acoplada (CCD) câmara (por exemplo CoolSNAP-HQ2 sistema de câmera digital) montada no microscópio usando o software de aquisição apropriado (por exemplo Metafluor) (Figura 3A). Feche o diafragma no caminho da luz de iluminação para limitar luz de excitação para a área de imagens. </li><li> Para gravar odor evocadoactividade, ajustar a taxa de aquisição a 4 Hz e ajustar o tempo de exposição para obter valores de fluorescência dentro da gama dinâmica da sua câmara CCD, mas não inferior a 1000 (unidades arbitrárias), com pelo menos resolução de 12 bits dinâmico. O tempo de exposição não deve exceder 100 ms, se possível, para reduzir a G-CAMP fotobranqueamento. Se a resolução espacial da sua câmara permite, é possível aumentar o binning (número de poços no chip que será binned em um pixel digital) para reduzir o tempo de exposição. Nós obter imagens de 350x225 pixels (com um binning de 2x2), correspondentes a 210x135 iM em preparação. Essas configurações são ótimas para capturar o odor glomerulares induzidas pela respostas de G-CAMP, com resolução espacial e temporal, limitando bom repórter de branqueamento. </li><li> Defina os parâmetros de medição. Nós tipicamente gravar durante 10 segundos (ou seja, 40 quadros), com a estimulação odor geralmente a partir de 4 segundos após o início do período de aquisição (quadro 15) e segundo um duradoura (uté quadro 19). Uma preparação de mosca pode normalmente ser testado com até 25-30 estímulos odor diferentes, muitas vezes limitada por uma diminuição irreversível o sinal fluorescente do repórter devido a fotodegradação. O intervalo estímulo inter-dependerá da força da resposta observada ea taxa de fotodegradação. O comprimento adequado de intervalo inter-estímulo para evitar adaptação sensorial pode ser determinada por aproximadamente apresentação repetida de um odor de controlo positivo (se conhecido) em experiências de ensaio. A inclusão deste odor a cada ~ 10 estímulos em uma dada série pode permitir a verificação da viabilidade e capacidade de resposta consistente da preparação. </li></ol> 5. Processamento de Dados e Análise Os dados são processados ​​usando ImageJ (com Mac biofotônica plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) e personalizadas programas escritos em Matlab e R como segue: <ol><li> Corrija para artefatos de movimento da amostra:alinhar todas as imagens correspondentes a uma preparação animal (por exemplo, 30 medidas de 40 frames cada) usando o "corpo rígido" modo de StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg</a> ) no ImageJ. Este passo é necessário para remover deslocamentos na posição dos neurónios marcados com respeito à armação aquisição dentro e entre as medições. No entanto, só é possível remover deslocamentos no plano xy. Os dados devem ser descartados se fortes mudanças em foco ocorrer. </li><li> Segmento da pilha em medições individuais de 10 segundos (40-frame). </li><li> Correta para o branqueamento de artefatos: a exposição à luz fluorescente causa fluorescência a decair durante uma única medição 10. Em alguns casos, é importante para corrigir esta decomposição antes de analisar os dados. Para cada medição calcular uma moldura de fundo. Esta deve ser a média de vários quadros antes do início do estímulo (quadros por exemplo, 6-14). Divida cada quadro por este backgarredondar moldura para obter as mudanças relativas de fluorescência. Calcular o valor médio relativo de fluorescência para cada quadro, pela média dos pixels dentro da área marcada por G-cAMP. Ajustar uma exponencial dupla para a curva média de fluorescência, dando mais forte de peso para os quadros antes do estímulo e zero peso com o tempo de resposta do odor (20 quadros após o início do estímulo, no nosso caso). Subtrair o curva ajustada a partir da curva em relação fluorescência de cada pixel. Multiplicar os quadros corrigidos pela armação de fundo para re-obter dados em bruto. Este tipo de correcção pode conduzir a uma modificação na dinâmica de resposta se o sinal não retornar à linha de base até ao final da medição (por exemplo, se inibitórios ou muito forte respostas excitatórias são evocadas) (Figura 4). Enquanto correcção de artefactos de branqueamento é útil em muitos casos, a interpretação de parâmetros temporais deve ser feita com precaução se uma correcção de lixívia é aplicado. </li><li> Calcula-se a alteração relativa na fluorescência (e Delta; F / F) para cada quadro de cada medição, (F i F-0) / F 0 * 100, onde F 0 é o quadro de fundo (ver 5.3), e F i o valor de fluorescência para o quadro ª i de a medição. </li><li> Calcular a média Af / F dentro de uma região circular de interesse numa glomérulo (Figura 3B) com um diâmetro de 10 pixels para obter os vestígios de actividade (Figura 5A). Se desejado, transformar estes vestígios em heatmaps usando ImageJ (Figura 5A). </li><li> Calcula-se a amplitude do pico da resposta subtraindo a média Af / F de quatro quadros antes do estímulo da Af média / F de quatro quadros durante o pico da resposta. O mesmo procedimento é usado tanto para ilustrar os padrões de resposta espacial (ver Figura 3B) e para quantificar a amplitude de resposta em regiões específicas de interesse através moscas (ver Figura 5B). O pico de resposta também pode ser quantificada por integração da área abaixo da curva, durante o tempo do estímulo, ou averaginos quadros g em todo o máximo da resposta. </li></ol> 6. Os resultados representativos Utilizou-se os protocolos acima, para registar e analisar propiónicos respostas ácido evocados de moscas que expressam G-CaMP1.6 28 sob o controlo do promotor para o co-receptor olfativo IR8a, que é activo em várias populações diferentes de ORS 29,30 ( As Figuras 3-5). A estimulação com 1% de ácido propiónico elicia aumentos em G-cAMP fluorescência - indicando aumentos na concentração de cálcio intracelular - em que inervam ORS dois glomérulos, DC4 e DP1l (Figura 3B). Nós ilustram diferentes formas de representação de dados a partir de moscas múltiplas na Figura 5: Vestígios de linha de actividade, Heatmaps e um gráfico de barra de respostas de pico. Respostas propiónico-evocados têm amplitudes de pico distintas e dinâmicas temporais em DC4 e DP1l. Além disso, embora as respostas são geralmente robusta, a variabilidade entre animais individuais também pode ser observada em ambos os glomérulos (ver eleatmaps na Figura 5A). Quantificação das respostas de pico (Figura 5B) permite que um simples comparação estatística entre glomérulos diferentes e diferentes odores através animais. No entanto, odor evocadas respostas de cálcio pode ter não uniformes dinâmica temporal, e quantificar a sua magnitude com um único valor irá desconsiderar essa complexidade. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 1"> Figura 1. Esquemático do bloco de montagem (A) antes e (B), após a introdução da mosca, e (C) vista de topo em uma estreita-se (adaptado a partir de 31). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> Figura 2. Esquemática do conjunto experimental. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 3"> Figura 3. (A) vista de cima da preparação mosca após o passo 2,8 (painel esquerdo) e imagem de fluorescência-prima do antelóbulos NNAL rotulado com G-CaMP1.6 (genótipo: promotor IR8a: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 e DP1l glomérulos podem ser distinguidos pela sua morfologia, tamanho e posição e estão marcadas em vermelho e azul, respectivamente. (B) da imagem com codificação de cores da resposta ao ácido propiónico (1% v / v). A imagem corresponde à Af / F do pico da resposta calculada conforme descrito na etapa 5,6 (ver também Figura 5A). O colorscale à esquerda indica o valor% Af / F. Os círculos negros indicam a posição e tamanho da região de interesse utilizado para quantificar as respostas (ver Figura 5). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 4"> Figura 4. Correcção de branqueamento do sinal de repórter fluorescente. Exemplos do efeito de correcção de lixívia como descrito no passo 5,3. Os dados de exemplo no painel esquerdo pode ser corrigido sem grandes mudanças na forma da resposta. Os dados de exemplo no painel da direita é afetar gravementeed por correcção lixívia, provavelmente porque o sinal cai e é mantida abaixo de linha de base após a cessação do estímulo odor. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 4"> A Figura 5 (A) superior:. Dinâmica temporal de respostas de cálcio de glomérulos DC4 (esquerda) e DP1l (direita) para o ácido propiónico (1% v / v). Os traços negros mostram a mediana da Af média / F na região de interesse (ver Figura 3B) em oito animais. A superfície cinza indica o intervalo entre os primeiro e terceiro quartil da distribuição. Apresentação dos valores medianos e quartis fornece mais informações sobre a variabilidade e distribuição de respostas observadas de média e erro padrão. As caixas de verde e magenta indicam os quadros para calcular a média das respostas máximas mostrados na Figura 3B, e quantificado na Figura 5B. Conclusão: os heatmaps mostrar os dados de resposta para todos os animais individuais em linhas separadas, com Af / F valores represented pelo colorscale (extrema direita). As barras horizontais pretas indicam o tempo ea duração do estímulo. (B) A mediana respostas de pico para ácido propiônico em oito animais para DC4 e glomérulos DP1l. As barras de erro indicam o intervalo entre primeiro e terceiro quartil da distribuição.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos de preparação e análise aqui descritos podem ser utilizados para analisar odor-evocados respostas em qualquer população de neurónios no lobo antenal (ORS, LN e PNS) para os quais um transgene condutor correspondente está disponível. Enquanto que descrevem a sua aplicação usando um microscópio de fluorescência, imagiologia óptica desta preparação pode igualmente ser realizada utilizando microscopia confocal ou dois fotões 22,32. Na verdade, estes últimos instrumentos aliviar o problema de dispersão da luz de largura microscopia de campo, que pode reduzir a resolução das imagens, especialmente quando grandes números de neurônios expressam o repórter. Esta preparação permite que geralmente gravações de odor-evocados respostas durante pelo menos meia hora, mas desta vez pode ser significativamente mais longo ou mais curto dependendo do número e comprimento das medições registadas, o tempo de exposição utilizada para cada quadro e do intervalo estímulo-Inter. Além disso, dois fótons excitação pode reduzir fotodegradação do representante fluorescenteorter, bem como fototoxicidade celular, para permitir a medição ao longo de períodos de tempo mais longos 22,32. Independentemente da escolha do microscópio, o movimento do cérebro da mosca dentro da cápsula cabeça é o problema mais recorrente quando imagem em animais intactos. Enquanto movimento de correção pode corrigir pequenos problemas (passo 5.1), normalmente é melhor apenas para gravar a partir de preparações altamente estáveis. Estratégias para reduzir artefatos de movimento incluem: (i) devidamente restringindo a probóscide da mosca com a coluna cacto; (ii) imobilizar pernas da mosca, fixando-lhes o palco com eicosane (antes do passo 2,6) (eicosane pode ser derretido em ~ 37 ° C; utilizar um fio de prata para estender e refinar a ponta do ferro de soldar para este fim), (iii) nicking do esófago (visível entre os nervos antenais) com uma pinça finas. Além disso a G-CaMP1.6 aqui utilizado, um número de versões optimizadas de G-cAMP e indicadores de cálcio estão disponíveis outros,que diferem na sua relação sinal-ruído, a fluorescência basal e dinâmica temporal 12,28,33. A escolha precisa do sensor deve levar em conta todas essas propriedades, o tipo de neurônios a serem analisados ​​ea questão biológica a ser abordado. Sensores de corrente relatam mudanças de cálcio que se correlacionam muito bem com potenciais de ação 12,34, e sua melhoria, juntamente com um número crescente de linhas específicas de driver genéticos 35 vai continuar a aumentar o potencial de imagem óptica da atividade neural na mosca intacta.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fornecedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cactus coluna </td><td> Jardim centro </td><td></td><td> ~ 7 milímetros longo fino, nem muito flexível </td></tr><tr><td> Resina </td><td> Loja instrumento de cordas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dois silicone componente </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Custom made bloco plexiglass de montagem </td><td> Plantas disponíveis a partir de <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Grelhas de cobre </td><td> Athene Grids </td><td> G220-5 </td><td> Normalmente utilizado para as amostras de microscopia eletrônica. </td></tr><tr><td> Parafusos </td><td> Loja de ferragens </td&gt; <td></td><td> 2 mm de diâmetro </td></tr><tr><td> Lamelas de plástico </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> Pontas de ferro de solda </td><td> Conrad Eletrônica </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de alimentação regulada </td><td> Conrad Eletrônica </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Arame fino </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 milímetro </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Zeiss </td><td> D1 Axioexaminer </td><td></td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Software de aquisição </td></tr><tr><td> Monocromador </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Lâminas quebráveis </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Suporte para lâmina </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire lâmina </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> De dois gumes lâmina de 1 mm </td></tr><tr><td> Bombas de membrana de gás </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Safira suporte da lâmina </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Três válvula unidirecional </td><td> Empresa Lee </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configuração de E </td></tr><tr><td> Rotâmetro 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotâmetro 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Cera de abelha </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Celulose pad </td><td> Kettenbach Medical </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologia # 5 </td></tr><tr><td> Seringas </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2 ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> Agulhas </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 milímetros OD </td></tr></tbody></table>

imagens de cálcio de odor-provocou respostas no drosophila lobo antenal

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

O lobo antenal é o principal centro olfativo no cérebro do inseto e representa o equivalente anatômica e funcional do bulbo olfativo de vertebrados 1-5. Informação olfactiva no mundo exterior é transmitido para o lobo antenal por olfactivos neurónios sensoriais (ORS), que segregam a regiões distintas de neurópilo chamados glomérulos de acordo com o receptor específico olfactivo que exprimem. Aqui, OSN axônios fazem sinapse com os interneurônios locais (LNS), cujos processos podem inervar muitos glomérulos diferentes, e neurônios de projeção (PNS), que transmitem informação olfativa para maiores regiões cerebrais olfativas. Imageamento óptico da atividade de ORS e linfonodos e RdP, no lobo antenal - tradicionalmente utilizando indicadores de cálcio sintéticos (por exemplo, cálcio verde, Fura-2) ou a tensão-sensíveis (por exemplo, corantes RH414) - tem sido uma técnica importante para entender como olfativo estímulos são representados como padrões espaciais e temporaisda atividade glomerular em muitas espécies de insetos 6-10. Desenvolvimento de geneticamente codificados repórteres de actividade neural, tais como os indicadores de cálcio fluorescentes G-cAMP e 11,12 Cameleon 13, o indicador de cálcio bioluminescente GFP-aequorin 14,15, ou um repórter da transmissão sináptica, synapto-pHluorin 16 fez com que o sistema olfativo da mosca da fruta, Drosophila melanogaster, particularmente acessível a imagem neurofisiológica, complementando seus exaustivamente descritos, propriedades moleculares, eletrofisiológica e neuroanatômica 2,4,17. Estes repórteres podem ser selectivamente expresso através binários sistemas de controlo da transcrição (eg GAL4/UAS 18, LexA / LexAOp 19,20, Q sistema 21) em populações definidas de neurónios no interior do circuito olfactivo para dissecar com resolução espacial e temporal de alta como odor-evocado atividade neural é representado, modulado e transformado 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Aqui descrevemos os métodos de preparação e de análise para medir odor evocadas respostas no lóbulo Drosophila antenal com G-CAMP 25-27. A preparação animal é minimamente invasiva e pode ser adaptado para imagiologia utilizando gama-campo microscópios de fluorescência, confocal e dois fotões.

Nós descrevemos uma técnica estabelecida para medir e analisar odor evocadas respostas de cálcio no lobo antenal de vida<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

O lobo antenal é o centro olfativo primário no cérebro do inseto e representa o equivalente anatômico e funcional do bulbo olfativo dos vertebrados...

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade fisiológica de neurônios olfativos em Drosophila e no lobo antenal por meio de imagem óptica das alterações intracelulares de cálcio. Isso é realizado primeiro montando o suporte de arame do bloco de fixação e o escudo da antena. Em seguida, uma mosca que expressa o sensor fluorescente de cálcio GCaMP é montada e fixada ao bloco.Uma vez montada a mosca, a cutícula na parte superior da cabeça da mosca é removida para expor os lobos antenais. O passo final do procedimento é posicionar a mosca sob o microscópio e estimulá-la com um odor. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram padrões de atividade induzidos por odor nos lobos antenais DLA, por meio de alterações registradas na fluorescência relativa do sensor de cálcio G camp.Este Método pode ajudar a revelar como os odores são representados como padrões espaciais e temporais de atividade neural em diferentes níveis da circuitaria olfativa. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como a eletrofisiologia, é que podemos registrar a atividade de neurônios geneticamente identificados que não são acessíveis a eletrodos de gravação. Embora este método possa fornecer insights sobre o processamento neural de odores.Também pode ser aplicado a outras regiões do cérebro de joof, como os sistemas auditivo e gassy. Primeiro, passe os parafusos através da parte traseira do bloco de montagem de plexiglass, de modo que não ultrapassem a frente. Use uma broca de precisão para fazer uma pequena reentrância na borda superior da câmara circular para a mosca, escavando sob a superfície para reduzir a espessura do bloco.Sob um microscópio estereoscópico, corte uma grade de cobre com um bisturi perpendicularmente e próximo à base da fenda para criar uma guia que segurará a mosca. Certifique-se de que as duas abas resultantes estejam niveladas, pois isso facilitará a inserção da mosca. Com um palito, coloque uma pequena gota de cola super resistente sobre o bloco de montagem acima da câmara circular.Para a mosca, coloque a grade de cobre sobre a cola e posicione-a de modo que a fenda fique centralizada no bloco. Pressione suavemente a grade e remova qualquer excesso de cola com uma pinça. Adicione pequenas gotas de cola sob as abas em cada lado e dobre a grade sobre a frente do bloco, de forma que a fenda fique apontando diretamente para baixo.Certifique-se de que a parte superior da grade esteja nivelada com o bloco e deixe secar completamente. Para fazer um suporte de arame, corte ao meio uma lamínula de plástico e remova uma parte central para formar um formato de U. Use cera de abelha para colar um pedaço de arame na parte superior do U, de modo que o arame não fique muito t.Construa uma blindagem de antena utilizando um furador de papel para fazer um furo em uma lamínula de plástico. Apare as bordas da lamínula para 0,5 por 0,7 centímetros. Cole a lamínula de plástico perfurada sobre uma fita adesiva e, em seguida, coloque uma gota de etanol sobre a fita exposta através do furo.Para remover o adesivo, anestesie moscas de um a três semanas de idade do genótipo apropriado resfriando-as em gelo. Sob o microscópio estereoscópico, pegue uma mosca pela articulação da asa e deslize-a com a superfície dorsal primeiro ao longo da grade de cobre, de modo que fique suspensa pelo pescoço. Se necessário, gire a mosca até que ela esteja olhando para baixo.Coloque uma fina espinho de cacto diante da cabeça da mosca para impedir que ela escape e posicione o espinho diante do probóscide para mantê-lo imóvel. Fixe o espinho de cacto ao bloco usando cera de abelha, certificando-se de que o topo da cabeça esteja alinhado com o topo do bloco. Fixe a cabeça da mosca ao bloco com uma pequena gota de breu dissolvido em etanol.Coloque o bloco em uma caixa umidificada e deixe a colofônia endurecer por cerca de uma hora. Usando pinça, puxe a placa da antena para frente e insira o suporte de arame no dobramento cuticular entre a antena e a cabeça. Fixe o suporte na parte frontal do bloco com mais cera de abelha.Usando os parafusos embutidos no bloco, empurre suavemente o suporte do fio para a frente para criar um pequeno espaço entre a placa da antena e a cabeça. Coloque o escudo da antena sobre a parte superior da cabeça da mosca, posicionando-o centralmente. Fixe o escudo à parte superior do bloco de montagem com cera de abelha.Usando um divisor de lâmina, corte um pequeno orifício na fita do escudo, expondo a cutícula da cabeça da mosca atrás da antena. O orifício não deve se estender além dos olhos para evitar vazamentos na preparação. Selle o orifício entre a fita e a cutícula com silicone de dois componentes.Remova qualquer excesso de silicone do topo da cabeça da mosca. Coloque uma gota de solução salina ringer para drosófila sobre a cabeça da mosca, certificando-se de que não haja vazamentos e de que as antenas permaneçam completamente secas. Usando uma lâmina de safira, faça um leve corte ao longo da dobra cuticular diretamente atrás da antena.Em seguida, corte ao longo dos olhos e transversalmente à sella na parte dorsal. Por fim, dobre o pedaço de cutícula sobre a borda marcada e corte a partir da face inferior. Para evitar seccionar os nervos antenais, remova cuidadosamente as glândulas e a traqueia com pinças finas.Lave repetidamente com solução ringer de Drosophila, deixando uma grande gota sobre a cabeça. Insira uma almofada de celulose em uma seringa plástica de dois mililitros com pinça limpa. Usando uma ponteira de pipeta filtrada, aplique 20 microlitros do odorante diluído.Ligue e tampe a seringa até que seja necessária para a imagem. Coloque a montagem contendo a mosca sob o microscópio. Abaixe a objetiva até que toque a solução de Ringer na cabeça da mosca.Observando pelo visor com iluminação em campo claro, posicione o preparado de modo que o orifício na cápsula cefálica fique centralizado e suas bordas estejam em foco. Mude para luz fluorescente e ajuste o foco até visualizar os neurônios marcados, que devem ser evidentes pela fluorescência verde basal do GCaMP. Adquira imagens com uma câmera CCD acoplada ao microscópio, utilizando o software apropriado para aquisição, e localize o foco nos glomérulos de interesse.Certifique-se de fechar o diafragma no trajeto da luz de iluminação para limitar a luz de excitação à área imageada. Posicione a saída do olfatômetro aproximadamente a 0,5 centímetros à frente das antenas das moscas. Aqui, os lóbulos anais são mostrados em uma mosca expressando GCaMP 1.6 sob o controle de um promotor de neurônio sensorial olfativo que induz expressão em vários glomérulos; a estimulação com ácido propiônico a 1% provoca aumentos na fluorescência de GCaMP, indicando elevações no cálcio intracelular, em neurônios sensoriais olfativos que inervam os glomérulos DC4 e DP1L. As dinâmicas temporais das respostas de cálcio nos glomérulos DC4 e DP1L ao ácido propiônico são mostradas aqui.Os traços pretos mostram a mediana da média de delta F sobre F dentro da região de interesse ao longo de oito animais, e a superfície cinza indica a faixa entre o primeiro e o terceiro quartis da distribuição. Os mapas de calor abaixo mostram as respostas dos animais individuais. As caixas magenta esverdeadas indicam os quadros médios utilizados para calcular as respostas máximas dos glomérulos acima dos níveis basais de fluorescência do GCaMP e são apresentadas quantificadas aqui.A correção do desbotamento do marcador fluorescente pode ter efeitos sobre a resposta. Os dados do pico da amostra no painel esquerdo podem ser corrigidos sem grandes alterações na forma da resposta. Os dados no painel direito são severamente afetados pela correção do desbotamento, provavelmente porque o sinal diminui e permanece abaixo da linha de base após a terminação do estímulo odorante. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de 30 minutos.Se realizado corretamente, ao tentar este procedimento, é importante manter a antena completamente seca, caso contrário ela será incapaz de detectar odores. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar, imaginar e analisar odores.Evocar atividade neuronal na mosca-das-frutas.

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

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Uma abordagem de imagem de cálcio permite o registro de respostas induzidas pelo paladar no cérebro de moscas acordadas enquanto uma solução é aplicada ao labelo. As respostas gustativas primárias em Drosophila melanogaster são usadas como exemplo, mas este protocolo pode ser adaptado para estudar neurônios a jusante ou outras espécies.

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Uma barreira significativa para o estudo da atividade celular durante processos cognitivos como aprendizado e memória é o uso de anestésicos para preparação de imagens in vivo . A anestesia prejudica a memória de curto prazo e a cognição em vários modelos, incluindo Drosophila. Este estudo apresenta um método único para preparar Drosophila adulta para imagens in vivo sem anestesia.

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Apresentamos protocolos de imagem de cálcio para um neurônio olfatório larval de Drosophila , usando um adesivo tecidual tópico para imobilização. Este método aumenta a estabilidade, facilitando experimentos in vivo e ex-vivo confiáveis. Os scripts R personalizados analisam os sinais de cálcio, fornecendo uma plataforma eficiente para pesquisas neurofisiológicas detalhadas.

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Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

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