JoVE Encyclopedia of Experiments
Pesquisa sobre o Câncer
0 vistas • 3:55 min • April 30th, 2023
Culturas organoides 3D de células cancerígenas recapitulam muitas características fisiopatológicas de cânceres humanos. Assim, essas culturas in vitro formam um excelente modelo para a pesquisa do câncer.
Para processar esses organoides, comece com uma cultura de organoides 3D pré-formados cultivados em uma matriz de membrana basal adequada. Adicione um meio de recuperação celular desejado e incube. O meio facilita a despolimerização do gel da matriz, liberando os organoides 3D na solução.
Centrifugue esta mistura para peletizar os organoides. A mídia de recuperação que contém os componentes da matriz permanece no sobrenadante. Descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione solução de paraformaldeído ao pellet organoide. O produto químico entra nas células organoides e se liga aos aminoácidos, causando reticulação de proteínas e fixação da amostra. Esta etapa é vital para qualquer aplicação histológica a jusante.
Pelotize os organoides para separar e remover o sobrenadante contendo paraformaldeído. Adicione agarose derretida quente aos organoides. Use uma agulha para destacar e dispersar os organoides peletizados na agarose líquida. Deixe a agarose solidificar e incorporar os organoides. Use o tampão de agarose contendo organoide para ensaios histológicos a jusante.
Para processar os organoides para histologia, remova o meio existente do poço, tomando cuidado para não aspirar as cúpulas da membrana basal. Adicione um volume igual de solução de recuperação celular e incube a placa por 60 minutos a 4 graus Celsius.
Após a incubação, desaloje a cúpula da membrana basal usando uma pipeta e esmague-a com a ponta da pipeta. Recolher a cúpula dissociada e a solução de recuperação celular num tubo de 1,5 mililitros. Centrifugue o tubo a 300 x g e 4 graus Celsius por 5 minutos, remova o sobrenadante e reserve.
Guarde todo o sobrenadante até a etapa final, quando a presença de organoides for confirmada. Adicione o volume desejado de PBS frio e pipete suavemente para cima e para baixo para desalojar mecanicamente o pellet sem interromper os organoides. Repita a centrifugação e remova o sobrenadante.
Fixe o pellet em um volume correspondente de 4% de PFA por 60 minutos em temperatura ambiente. Após a fixação, repita a etapa de centrifugação e a lavagem com PBS. Em seguida, adicione lentamente 200 microlitros de agarose a 2% quente e retire imediatamente, mas suavemente, o pellet celular da parede do tubo sem interrompê-lo usando uma agulha de calibre 25 conectada a uma seringa de 1 mililitro.
Para o método de rotação de agarose, é fundamental separar o pellet celular da parede do tubo logo após adicionar agarose usando uma agulha de calibre 25.
Assim que a agarose estiver completamente solidificada, retire-a do tubo com uma agulha de calibre 25 conectada a uma seringa de 1 mililitro e transfira-a para um novo tubo de 1,5 mililitro. Encha o tubo com etanol a 70% e prossiga com o protocolo convencional de desidratação tecidual e inclusão de parafina.