Ensaio de spin down de agarose: uma técnica para incorporar organoides para análise histológica

Culturas organoides 3D de células cancerígenas recapitulam muitas características fisiopatológicas de cânceres humanos. Assim, essas culturas in vitro formam um excelente modelo para a pesquisa do câncer.

Para processar esses organoides, comece com uma cultura de organoides 3D pré-formados cultivados em uma matriz de membrana basal adequada. Adicione um meio de recuperação celular desejado e incube. O meio facilita a despolimerização do gel da matriz, liberando os organoides 3D na solução.

Centrifugue esta mistura para peletizar os organoides. A mídia de recuperação que contém os componentes da matriz permanece no sobrenadante. Descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione solução de paraformaldeído ao pellet organoide. O produto químico entra nas células organoides e se liga aos aminoácidos, causando reticulação de proteínas e fixação da amostra. Esta etapa é vital para qualquer aplicação histológica a jusante.

Pelotize os organoides para separar e remover o sobrenadante contendo paraformaldeído. Adicione agarose derretida quente aos organoides. Use uma agulha para destacar e dispersar os organoides peletizados na agarose líquida. Deixe a agarose solidificar e incorporar os organoides. Use o tampão de agarose contendo organoide para ensaios histológicos a jusante.

Para processar os organoides para histologia, remova o meio existente do poço, tomando cuidado para não aspirar as cúpulas da membrana basal. Adicione um volume igual de solução de recuperação celular e incube a placa por 60 minutos a 4 graus Celsius.

Após a incubação, desaloje a cúpula da membrana basal usando uma pipeta e esmague-a com a ponta da pipeta. Recolher a cúpula dissociada e a solução de recuperação celular num tubo de 1,5 mililitros. Centrifugue o tubo a 300 x g e 4 graus Celsius por 5 minutos, remova o sobrenadante e reserve.

Guarde todo o sobrenadante até a etapa final, quando a presença de organoides for confirmada. Adicione o volume desejado de PBS frio e pipete suavemente para cima e para baixo para desalojar mecanicamente o pellet sem interromper os organoides. Repita a centrifugação e remova o sobrenadante.

Fixe o pellet em um volume correspondente de 4% de PFA por 60 minutos em temperatura ambiente. Após a fixação, repita a etapa de centrifugação e a lavagem com PBS. Em seguida, adicione lentamente 200 microlitros de agarose a 2% quente e retire imediatamente, mas suavemente, o pellet celular da parede do tubo sem interrompê-lo usando uma agulha de calibre 25 conectada a uma seringa de 1 mililitro.

Para o método de rotação de agarose, é fundamental separar o pellet celular da parede do tubo logo após adicionar agarose usando uma agulha de calibre 25.

Assim que a agarose estiver completamente solidificada, retire-a do tubo com uma agulha de calibre 25 conectada a uma seringa de 1 mililitro e transfira-a para um novo tubo de 1,5 mililitro. Encha o tubo com etanol a 70% e prossiga com o protocolo convencional de desidratação tecidual e inclusão de parafina.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.