Ensaio de organoide de próstata: uma técnica de cultura ex vivo baseada em anel de gel de matriz para estudar a capacidade de diferenciação de células epiteliais da próstata

O epitélio da próstata compreende principalmente células epiteliais basais e epiteliais luminais. Uma monocamada de células basais forma o revestimento externo da glândula e suporta a sobrevivência das células luminais. Por outro lado, as células luminais revestem o lúmen e secretam proteínas específicas da próstata.

Para estudar a diferenciação epitelial prostática ex vivo, comece com uma suspensão de células epiteliais basais da próstata. Misture a suspensão com uma matriz de membrana basal resfriada na proporção desejada. Pipete esta mistura junto à base da parede interior de uma placa de cultura repelente de células. Gire o prato para que a mistura forme um anel ao longo da circunferência do poço.

Incube a placa para permitir que a matriz se solidifique. Complemente a cultura com uma mídia preferida. Os fatores de crescimento na mídia suportam a proliferação de células epiteliais basais. Ao mesmo tempo, a natureza repelente de células da placa de cultura impede qualquer ligação celular, incentivando as células a formar esferóides 3D dentro da matriz.

Com o tempo, os esferóides desenvolvem lúmens delimitados por epitélio de várias camadas. As células epiteliais basais que revestem o lúmen eventualmente se diferenciam e formam células luminais secretoras, dando origem a estruturas glandulares 3D.

Comece este procedimento com a preparação de células epiteliais basais e luminais da próstata de camundongo, conforme descrito no protocolo de texto. Lave o pellet celular em 500 microlitros de meio organoide de camundongo. Em seguida, ressuspenda o pellet a uma densidade celular de 1.000 células por microlitro. Para preparar misturas mestras, misture células epiteliais suspensas em meio organoide de camundongo com gel de matriz para gerar uma mistura final que contenha 25% de células em meio e 75% de gel de matriz. Dependendo da aplicação a jusante, as células basais são normalmente plaqueadas a uma concentração de 100 a 2.000 células por 80 microlitros, enquanto as células luminais são plaqueadas a uma concentração de 2.000 a 10.000 células por 80 microlitros.

Para cada mistura de células, adicione 80 microlitros do gel da matriz por poço de uma placa de 24 poços. Pipetar uma gota na metade inferior da parede do poço, evitando o contato direto com o revestimento de poli-HEMA. Depois de adicionar o gel da matriz, gire a placa para permitir que a mistura de células do gel da matriz forme um anel ao redor da borda do poço. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora de 37 graus Celsius 5% de CO2, com o lado direito para cima, por 10 minutos para permitir que o gel da matriz endureça parcialmente.

Depois de incubar por 10 minutos, vire a placa de 24 poços de cabeça para baixo e incube por mais 50 minutos para permitir que o gel da matriz endureça completamente. Em seguida, adicione 350 microlitros de mídia organoide de camundongo pré-aquecida, gota a gota, no centro de cada poço. Depois de adicionar a mídia, retorne a placa de 24 poços para a incubadora.

Para reabastecer o meio organoide do mouse, incline a placa de 24 poços em um ângulo de 45 graus e remova suavemente o meio existente do centro de cada poço usando uma pipeta P1000, evitando o anel de gel da matriz. Adicione 350 microlitros de mídia organoide de mouse pré-aquecida como antes. Recomenda-se adicionar um volume maior de meio aos organoides cultivados por mais de cinco dias para evitar o rápido esgotamento dos principais nutrientes e fatores de crescimento.

• Prostate Epithelium - Consists of basal and luminal cells forming the prostate gland's structure.
• Basal Cells - Cells forming the outer lining of the prostate epithelium.
• Luminal Cells - Cells lining the lumen of the prostate gland and secreting prostate-specific proteins.
• 3D Spheroids - Cell structures formed in a cell-repellent environment.
• Organoid Assay - A method to study cell differentiation and formation of 3D glandular structures ex vivo.

• Introduction to Prostate Epithelium - It is formed of basal and luminal cells (e.g., prostate epithelial cells).
• Outline of Cellular Components - Basal cells support luminal cell survival; luminal cells line the lumen (e.g., organoid assay).
• Explanation of 3D Spheroids Formation - Grown within a matrix in a cell-repellent environment.
• Connection to Experiment - Formation of luminal cells from basal cells in 3D glandular structures.

• What are prostate epithelial cells and their role in the prostate epithelium?
• How does the organoid assay contribute to the study of prostatic epithelial differentiation?
• What is the process of 3D spheroids formation in a cell-repellent environment?

• Practical Applications - Used to study cell differentiation and formation of glandular structures ex vivo (e.g., organoid assay).
• Industry Impact - Crucial for biomedical research and development in urology (e.g., prostate health).
• Societal Importance - Contributes to better understanding and treatment of prostate diseases (e.g., prostate cancer).
• Scientific Advancements - Enabled the study of prostate cell proliferation and differentiation.