Extração de lisado de proteína: uma técnica para lisar organoides para coletar proteínas celulares

O lisado celular, ou o fluido que contém o conteúdo celular lisado, encontra aplicação em processos a jusante, como extrações e análises de proteínas. O estudo dessas frações revela informações sobre as características e funções das células.

Para preparar lisados de proteínas organoides, comece com uma cultura de organoides cultivados em uma matriz de membrana basal desejada. Remova os meios de cultura gastos do prato. Adicione meios quentes contendo proteases sobre a matriz. Pipet repetidamente para desalojar a matriz do prato.

Incube a mistura. As enzimas proteolíticas no meio degradam a matriz e liberam os organoides na solução. Centrifugue a amostra para separar os organoides do sobrenadante contendo enzimas.

Ressuspenda o pellet organoide em um tampão de lise de proteína adequado. Incubar a amostra. Os detergentes no tampão rompem as membranas celulares dos organoides, liberando conteúdo intracelular na solução. Ao mesmo tempo, os inibidores de proteínas no tampão inativam quaisquer enzimas protease e fosfatase liberadas, impedindo a degradação de suas proteínas substratos.

Além disso, sonice a mistura para romper completamente as células. O envelope nuclear se rompe e libera proteínas nucleares na solução. As ondas sônicas também cortam os ácidos nucléicos liberados, evitando que contaminem o lisado de proteínas.

Para coletar organoides, jatee repetidamente o gel da matriz pipetando 1 mililitro de mídia contendo dispase pré-aquecida diretamente no anel de gel da matriz até que todo o anel seja desalojado. Transfira a mistura organoide de gel de matriz desalojada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Após a digestão completa, conforme descrito no protocolo de texto, adicione solução salina tamponada com fosfato ao pellet organoide e ressuspenda sacudindo suavemente.

Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com uma micropipeta. Ressuspenda os grânulos organoides em 100 microlitros de tampão de lise de proteína por 10 microlitros de volume de células compactadas. Deslize para ressuspender. Agora, sonice os organoides submergindo tubos em gelo úmido e aplicando suavemente a ponta do desmagnetizador sônico na parte externa do tubo da microcentrífuga. Sonicar por 40 segundos a 20 kHz antes de prosseguir para western blotting com protocolos estabelecidos.