Imagem de imunofluorescência de montagem total: uma técnica de fixação e coloração para avaliar organoides intactos

Os organoides da próstata constituem principalmente uma camada externa de células epiteliais basais e camadas internas de células epiteliais luminais dispostas em torno de um lúmen central.

A imagem de montagem total permite o estudo de organoides 3D intactos, mantendo sua morfologia e heterogeneidade. Para iniciar a coloração, trate os organoides com um fixador adequado para travar seus componentes celulares no lugar, preservando-os. Lave a amostra para remover o excesso de fixadores.

Incube com um coquetel de solução de bloqueio e corante de coloração de DNA. As proteínas na solução de bloqueio ligam-se passivamente a locais não específicos das células e reduzem qualquer coloração de fundo. Ao mesmo tempo, o corante de coloração de DNA mancha os núcleos das células.

Adicione dois conjuntos de anticorpos primários direcionados a antígenos específicos expressos pelas duas populações de células constituintes. Incube com dois anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente diferentes que se ligam aos anticorpos primários. Lave a amostra para remover quaisquer anticorpos não ligados.

Mergulhe os organoides corados sequencialmente em concentrações crescentes de soluções de açúcar contendo surfactante para melhorar a transparência do tecido sem comprometer a arquitetura do organoide. Este tratamento aumenta a profundidade de imagem da amostra.

Monte os organoides em uma lâmina de microscópio carregando espaçadores para preservar sua morfologia 3D durante a geração de imagens. Use um microscópio confocal para observar as emissões de fluorescência das populações de células basais e luminais dispostas ao redor do lúmen central.

Para realizar a coloração de imunofluorescência de montagem total de organoides da próstata, primeiro adicione 500 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS. Incube os organoides por 2 horas em temperatura ambiente com agitação suave. Depois de lavar o pellet conforme descrito no protocolo de texto, adicione 1 micrograma por mililitro de corante DAPI na solução de bloqueio e incube por 2 horas em temperatura ambiente. Proteja a amostra da luz durante a incubação a partir deste passo à frente. Após a centrifugação dos organoides como antes, adicione o anticorpo primário e a solução de bloqueio e incube durante a noite a 4 graus Celsius com agitação suave.

Pellet os organoides novamente e lave o pellet com 1 mililitro de PBS por 15 minutos com agitação suave. Repita este procedimento de lavagem duas vezes. Em seguida, adicione anticorpo secundário e solução de bloqueio e incube durante a noite a 4 graus Celsius com agitação suave. Após a incubação, pellet os organoides e lave o pellet por mais duas vezes. Adicione 1 mililitro de sacarose a 30% em PBS com 1% de Triton X-100 aos organoides peletizados. Em seguida, incube por 2 horas em temperatura ambiente com agitação suave.

Depois de peletizar os organoides novamente, adicione 1 mililitro de sacarose a 45% em PBS com 1% de Triton X-100 e agite suavemente por 2 horas em temperatura ambiente. Em seguida, repita o procedimento, exceto adicionar 1 mililitro de sacarose a 60% em PBS com 1% de Triton X-100. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover 95% do sobrenadante. Observe o pellet sob luz ultravioleta para confirmar que não foi perdido durante a remoção do sobrenadante. O pellet fica mais solto à medida que a concentração de sacarose aumenta. Transfira 10 a 20 microlitros da suspensão restante para uma lamínula com câmara e prossiga para a microscopia confocal.