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Comece com uma amostra de tecido tumoral de próstata. Ressuspenda-o em um tampão de lise resfriado para iniciar a lise celular. Use um homogeneizador para quebrar ainda mais as estruturas do tecido e liberar seus componentes intracelulares. Sonicar a amostra no gelo para garantir a lise celular completa e cisalhar o DNA para evitar interferência durante o processamento do peptídeo. Aqueça o lisado para interromper a estrutura terciária das proteínas e se desdobrar.
Os agentes redutores no tampão clivam as ligações dissulfeto entre os resíduos de cisteína. Posteriormente, os agentes alquilantes no tampão alquilam grupos tióis livres de cisteínas reduzidas para evitar a reforma da ligação dissulfeto. Os agentes desnaturantes adicionais no tampão facilitam a desnaturação controlada e o desdobramento adicional das proteínas.
Centrifugue para peletizar os detritos do tecido e quaisquer contaminantes. Recolher o sobrenadante que contém a mistura de proteínas num tubo novo. Adicione a enzima lisil endopeptidase para clivar as ligações peptídicas em proteínas no terminal C dos resíduos de lisina, formando grandes peptídeos. Além disso, trate com a enzima tripsina para clivar as ligações peptídicas no terminal C dos resíduos de lisina e arginina e gerar peptídeos menores. Transfira a mistura para uma unidade de filtro centrífugo.
Centrifugue para permitir que os peptídeos digeridos permeiem através dos poros da membrana do filtro e se coletem como fluxo. Quaisquer fragmentos maiores permanecem como o retentado.
Para colher tecido tumoral, pesar o tumor e, em um tubo de ensaio de cultura, adicionar 2 mililitros de tampão de lise gelada para cada 100 miligramas de tecido. Em seguida, use um homogeneizador portátil ou de bancada para homogeneizar o lisado.
Para reduzir e alquilar a amostra, aqueça o tubo a 95 graus Celsius por 5 minutos e, em seguida, resfrie a amostra no gelo por 15 minutos. Ainda no gelo, sonicar o lisado três vezes. Em seguida, aqueça a amostra a 95 graus Celsius por 5 minutos.
Coloque este tubo de sonicação em um rotor de caçamba oscilante e centrifugue o lisado a 3.500 x g e 15 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, colete o sobrenadante e descarte o pellet. Para digerir o lisado, use 100 milimolares Tris para diluir a amostra 12 vezes para reduzir a quantidade de guanidínio. Para 5 miligramas de proteína, adicione 10 microgramas de Lisil Endopeptidase, ou Lys-C, e incube a amostra em temperatura ambiente por 5 a 6 horas.
Prepare 1 miligrama por mililitro de tripsina tratada com TPCK em HCl 1 milimolar com cloreto de cálcio 20 milimolar e tripsina adicionados a uma proporção de 1 para 100 tripsina para proteína. Incubar a amostra a 37 graus Celsius por 3 horas. Em seguida, adicione uma alíquota adicional de tripsina ao tubo e incube a amostra a 37 graus Celsius durante a noite.
Adicione a amostra a um filtro de corte de 15 mililitros e 10 kDa. Centrifugue a amostra em um balde oscilante ou rotor de ângulo fixo a 3.500 x g e 15 graus Celsius até que o volume de retentado seja inferior a 250 microlitros. Em seguida, colete o fluxo e descarte o retentado.