Extração de proteínas e proteólise: um método para obter proteínas de amostras de tecido tumoral de próstata e sua digestão enzimática em peptídeos

Comece com uma amostra de tecido tumoral de próstata. Ressuspenda-o em um tampão de lise resfriado para iniciar a lise celular. Use um homogeneizador para quebrar ainda mais as estruturas do tecido e liberar seus componentes intracelulares. Sonicar a amostra no gelo para garantir a lise celular completa e cisalhar o DNA para evitar interferência durante o processamento do peptídeo. Aqueça o lisado para interromper a estrutura terciária das proteínas e se desdobrar.

Os agentes redutores no tampão clivam as ligações dissulfeto entre os resíduos de cisteína. Posteriormente, os agentes alquilantes no tampão alquilam grupos tióis livres de cisteínas reduzidas para evitar a reforma da ligação dissulfeto. Os agentes desnaturantes adicionais no tampão facilitam a desnaturação controlada e o desdobramento adicional das proteínas.

Centrifugue para peletizar os detritos do tecido e quaisquer contaminantes. Recolher o sobrenadante que contém a mistura de proteínas num tubo novo. Adicione a enzima lisil endopeptidase para clivar as ligações peptídicas em proteínas no terminal C dos resíduos de lisina, formando grandes peptídeos. Além disso, trate com a enzima tripsina para clivar as ligações pe